Identificatie van de bacteriële gemeenschappen op marien plastic afval
Het dagelijks gebruik van plastic in onze maatschappij blijft toenemen terwijl deze synthetische polymeren nauwelijks degraderen. Daarom is het belangrijk de problematiek rond plastic zwerfvuil in het marien milieu in kaart te brengen. Zeer actueel zijn de trieste foto’s van door plastic afval verstrikte, verwonde, gestikte of uitgehongerde zeedieren. Dieper onderzoek is echter noodzakelijk om ook de impact van de kleinere plastic partikels zoals microplastics en nanoplastics te kunnen evalueren. Deze partikels kunnen opgenomen worden door mariene organismen zoals de mossel waarna ze kunnen accumuleren in het weefsel. Persistente polluenten kunnen accumuleren op deze microplastics en een bijkomende impact uitoefenen op het mariene ecosysteem. Plastic afval en microplastics blijken eveneens als habitat te fungeren voor tal van mariene micro-organismen. Uit onderzoek blijkt dat sommige mariene bacteriën zelfs in staat zouden zijn de synthetische polymeren te biodegraderen. Hoe dit gebeurt en welke effecten dit zal hebben op het ecosysteem is echter nog een groot vraagteken.
Aangezien mariene bacteriën zeer moeilijk te cultiveren zijn, bestaat er een grote interesse naar het isoleren, cultiveren en identificeren van mariene bacteriën. In het kader van de Europese onderzoeksprojecten MICRO (InterReg 2 Zeeën) en CleanSea (7KP) wordt onderzoek verricht naar de identificatie van bacteriële gemeenschappen en bacteriële biodegradatie van marien plastic afval. Dit eindwerk behandelt verschillende methodes voor de identificatie van bacteriële gemeenschappen op microplastics, plastic strandafval en marien plastic zwerfvuil. Vervolgens wordt er nagegaan met een microkosmos experiment welke opportunistische bacteriën zich preferentieel op het plastic zullen hechten. Er zal gebruik gemaakt worden van zowel microbiologische als moleculair biotechnologische technieken om de isolatie, cultivatie en identificatie van mariene bacteriën te verwezenlijken.
Hiervoor worden verschillende opwerkingsmedia, voedingsbodems, incubatietijden en -temperaturen uitgetest. Na optimalisatie wordt besloten gebruik te maken van een isolatie in Maximum Recovery Diluent (MRD) met behulp van een vortex-methode en een cultivatie op Marine Agar (MA) en Plate Count Agar (PCA). Gegroeide kolonies worden vervolgens op twee manieren opgewerkt. In de eerste methode wordt een kolonie PCR uitgevoerd waarbij gescheiden kolonies aangeprikt worden en overgebracht worden in PCR mix. In de tweede methode worden volledige swabs afgenomen van de begroeide platen. Het geëxtraheerde DNA van de swabs wordt vervolgens geamplificeerd en gescheiden via denaturerende gradiënt gelelektroforese (DGGE). Enkele testen werden uitgevoerd waarbij DNA rechtstreeks zonder cultivatie geëxtraheerd werd uit de stalen met behulp van sonificatie of Retsch methode. Voor de identificatie wordt gebruik gemaakt van een amplificatie van de V3 regio op het 16S fragment. Opgezuiverde PCR fragmenten werden tot slot verzonden naar Macrogen waar ze gesequeneerd werden. Binnen de 24 uur waren de resultaten beschikbaar zijn voor een verdere data analyse. De verkregen sequenties werden vervolgens verwerkt met de gepaste software en geanalyseerd in de databank NCBI BLAST.
Het microkosmos experiment werd uitgevoerd in glazen 500 ml bokalen die gevuld worden met zeewater of sediment. Hierin werden vervolgens bacterievrije plastic pellets of synthetische vezels gebracht. Gedurende 1 maand werden deze plastic stukjes blootgesteld aan zeewater of sediment, waarbij 4 bemonsteringen plaatsvinden voor de identificatie van aanwezige bacteriën op het plastic.
Voor de cultivatie van mariene bacteriën blijkt MA het beste medium. Hierop werden 20 verschillende species geïdentificeerd terwijl er op PCA slechts 11 verschillende werden aangetroffen.
De geïdentificeerde bacteriën op het plastic afval behoren voornamelijk tot de klassen van de Gamma Proteobacteria, Actinobacteria, Bacilli en Flavobacteria. Vele aangetroffen bacteriën zoals Pseudoalteromonas sp., Acinetobacter sp., Alteromonas sp., Vibrio sp. en Psychrobacter sp. kunnen verwacht worden in een aquatisch milieu. Wat opvalt, is dat een aantal bacteriën, behorend tot de klasse van de Actinobacteria, enkel aangetroffen werden op de preproductie pellets van het strand, terwijl ze niet op het strandafval noch op het afval uit zee gevonden werden. Op marien afval werden enkel bacteriën geïdentificeerd die behoren tot de klasse van de Gammaproteobacteria. Enkele mariene soorten zoals Vibrio sp. en Shewanella sp. werden zelfs enkel teruggevonden op het plastic uit zee en kunnen niet in verband gebracht worden met het strandafval.
Uit het microkosmos experiment blijkt dat bacteriën uit het zeewater in staat zijn om het plastic te koloniseren. Bacteriën zoals Shewanella sp., Pseudoalteromonas sp. en Colwellia sp. werden geïdentificeerd als opportunistische soorten.
Dit eindwerk draagt bij tot de studie van de microbiële biodiversiteit en karakterisatie van het marien milieu, wat relevant is voor ondermeer de evaluatie van de zwemwaterkwaliteit en toepassingen binnen de aquacultuur sector. Dit eindwerk vormt een eerste stap in het onderzoek naar de topic bacteriële biodegradatie van marien plastic zwerfvuil.
