ANABOLIC RESPONSE TO ORAL LEUCINE ADMINISTRATION IS IMPAIRED IN SKELETAL MUSCLE OF PHD1 KO MICE

Kan leucine de gekende negatieve gevolgen van aandoeningen zoals bloedarmoede en chronisch longlijden op spiermassa verminderen?

Iedereen weet hoe het voelt als je een inspanning doet op hoogte. Skiën, fietsen, wandelen of lopen voelt veel uitputtender aan op 3000m hoogte dan bij ons in België op zeeniveau. De hoogte zorgt er immers voor dat je minder zuurstof kan inademen.

Patiënten die lijden aan bepaalde bloed- of longziekten kampen met zo’n chronisch tekort aan zuurstof, ook ‘hypoxie’ genoemd. Één van de belangrijkste symptomen van zulke ziektes is een zeer sterk verlies aan spiermassa. Dit gebeurt omdat langdurige zuurstofnood de aanmaak en afbraak van eiwitten, de bouwstenen van spieren, negatief beïnvloedt. Deze spieratrofie, of het verminderen van de doorsnede en dus massa van spiercellen, kan leiden tot krachtverlies, wat allerlei negatieve gevolgen met zich mee brengt, zoals een daling van levenskwaliteit en vergroot gevaar op vallen en blessures. Reeds geruime tijd is de mens naar middelen op zoek om dit verlies aan kracht tegen te gaan. Zo zijn bepaalde stimuli zoals krachttraining en eiwitinname mogelijkheden om spieratrofie tegen te gaan. Interessant genoeg blijkt het essentiële (het lichaam kan het zelf niet aanmaken) aminozuur ‘leucine’ een belangrijke en specifieke functie te hebben in de synthese van nieuwe eiwitten.

Nieuwe eiwitten worden gevormd via overschrijving (transcriptie) van DNA tot mRNA. En mRNA wordt op zijn beurt via een proces dat vertaling (translatie) wordt genoemd, omgebouwd tot proteïnen. Het is deze translatie die beïnvloedt wordt door leucine en andere externe stimuli zoals voedingsmiddelen, hypoxie, ...

mTOR (mammalian target of rapamycin) is een sleutelmolecule in dit proces. Het combineert alle externe signalen om de aanmaak en afbraak van eiwitten te controleren. Hormonen zoals insuline activeren een cascade van enzymes die mTOR activeren, waardoor mTOR andere doelen kan activeren. Dit leidt uiteindelijk tot activatie van proteïnesynthese.

Aan de ene kant hebben we dus de nefaste effecten van chronische hypoxie en aan de andere kant de positieve invloed van leucine op het eiwitmetabolisme en spieraanmaak.  De vraag die vooropgesteld wordt in dit onderzoek luidt als volgt:

Kan leucine, dat dagelijks via de voeding wordt ingenomen, de gekende negatieve gevolgen van aandoeningen zoals bloedarmoede en chronisch longlijden op spiermassa verminderen en/of verhelpen?

Om ethische en logistieke redenen en omwille van problemen van standaardisatie is het zeer moeilijk  onderzoek te doen bij mensen die gedurende een lange tijd op hoogte verblijven. Daarom hebben we dit onderzoek verricht op genetisch gemodificeerde muizen die het gen PHD1 (prolyl-hydroxylase 1) niet hadden. Prolyl-hydroxylase 1 zijn enzymen die ‘voelen’ wanneer er genoeg zuurstof voorhanden is in de cel. Wanneer deze enzymen ontbreken, zoals bv. bij deze muizen, gaat een ander molecule hypoxia-inducible-factor of HIF sterk tot expressie komen, omdat het niet meer kan afgebroken worden. Kort gezegd, we hebben onze muizen zo genetisch veranderd dat ze als het ware ‘chronisch’ op ‘hoogte’ leven. Ook al leven ze gewoon bij ons op het sportkot in Leuven, op zeeniveau.

Om onze vooropgestelde hypothese te testen - gaat het gemodificeerde type muizen nu minder goed reageren op de toediening van leucine?- hebben we 4 groepen gemaakt. Ze staan opgelijst in onderstaande tabel:

Tabel 1: groepen die gecreëerd warden voor de studie

Groep

Type muis

Toediening van?

Aantal?

Naam

1

Wild type, geen modificatie

Water

5

WT/CTRL

2

Wild type, geen modificatie

Leucine

6

WT/LEU

3

PHD genetisch gemodificieerd

Water

7

KO/CTRL

4

PHD genetisch gemodificieerd

Leucine

7

KO/LEU

Op de dag van het experiment werden de muizen nuchter (ze hadden al 8 uur niet gegeten) naar het labo spierfysiologie op het sportkot gebracht. Achtereenvolgens werd dan water of leucine ingebracht bij elke muis van elke groep. Er werd 30 minuten gewacht zodat de stof kon worden opgenomen in het bloed. Hierna werden de muizen in slaap gebracht en werden de verschillende spieren en organen eruit genomen. Deze werden meteen in vloeibare stikstof gedaan om alle fysiologische processen stil te leggen. Deze stalen werden dan opgeslagen in een zeer koude diepvries (-80°C).

Een maand later werden deze stalen geanalyseerd in het labo via de techniek western blot, dit is een van de meest gebruikte technieken in de biochemie. Kort gezegd worden er met behulp van antilichamen specifieke moleculen (ook eiwitten) onderzocht. Hieruit kan men dan afleiden of er meer of minder eiwitsynthese of -afbraak is.

Hoe zagen de resultaten eruit? Bij het analyseren van de stalen bekomen we een figuur die er typisch uitziet zoals Figuur 1 (zie bijlage). In de X-as staan de verschillende groepen (zie tabel 1), in de y-as staat de ‘activatie’ van een specifiek eiwit dat te maken heeft met eiwitaanmaak en dus spiergroei. 

Er vallen 2 zaken op.

• Leucine zorgt voor een activatie van eiwitsynthese in gezonde normale wild type muizen.
• In de genetisch gemodificeerde muizen is er al een sterke activatie in nuchtere toestand. Deze activatie wordt teniet gedaan door toediening van leucine.

Wat kunnen we hieruit afleiden? Het is duidelijk dat de modificatie van de muizen, die zorgt voor een ‘constante hypoxische stimulus’ iets teweeg brengt in hun spiercellen. Ze  creëren een soort overgevoeligheid in nuchtere toestand en toediening van leucine doet deze overgevoeligheid teniet.

Dit onderzoek is slechts het prille begin van de ontrafeling van moleculaire pathways die te maken hebben met eiwitsynthese en zuurstofnood. Verdere studies zijn nodig om die ‘overgevoeligheid’ te bepalen bij de gemodificeerde  muizen. Deze studie bevestigt het cliché ‘hoe meer je weet, hoe meer je beseft dat je niet weet’, maar dat maakt wetenschappelijk onderzoek juist zo interessant.