Optimalisatie van een detectiemethode voor hepatitis E in varkenslever

Sjarlotte Willems
Persbericht

Optimalisatie van een detectiemethode voor hepatitis E in varkenslever

Het hepatitis E virus (HEV) veroorzaakt leverontsteking, net als de andere vijf hepatitis virussen (A, B, C, D en G). Het verschil zit vooral in de besmettingsroute, de klachten en de ernst van de ziekte. Zo kan HEV overgedragen worden van dier op mens via 3 verschillende wegen namelijk via fecaal-orale weg, via besmette levensmiddelen of via transfusie en bloeddonatie. Momenteel is HEV infectie moeilijk te behandelen maar de overdracht van het virus kan wel voorkomen worden.

De opzet van dit onderzoek is het optimaliseren van een detectiemethode voor HEV op basis van qPCR naar aanleiding van groeiende bezorgdheid over de overdracht van HEV via besmette levensmiddelen en in het bijzondere varkenslever.

In een eerste fase wordt de qPCR-detectiemethode geoptimaliseerd uitgaande van 3 methoden die beschreven zijn in de literatuur. Hierbij worden primer- en probecombinaties met bijhorende qPCR-programma’s getest gebruikmakend van een HEV-gBlock fragment (= synthetisch DNA fragment dat een gedeelte van het HEV-genoom bevat). Hieruit is gebleken dat met de primer- en probecombinatie  beschreven door Pas et al [1] de beste resultaten worden bekomen. Deze primer- en probecombinatie met bijhorende qPCR-programma is geselecteerd voor gebruik in verdere analyses. Als procescontrole wordt gebruik gemaakt van het murine norovirus waarvoor ook een primer- en probecombinatie met bijhorend qPCR-programma beschreven door Stals et al [2] getest wordt met behulp van het MNV-1 gBlock fragment.

Vervolgens wordt de reverse transcriptie stap of cDNA-synthese geoptimaliseerd aan de hand van het WHO HEV RNA referentiemateriaal. Dit referentiemateriaal wordt in verschillende verdunningen en hoeveelheden getest in de mastermix. De resultaten bekomen met 1 µl onverdund referentiemateriaal verschillen heel weinig met de te verwachte waarden waarbij besloten wordt om hiermee verder te werken telkens als controle voor de cDNA-synthese.

In een derde fase wordt de RNA-extractie gebruikmakend van de RNeasy Mini kit (Qiagen) getest aan de hand van humaan HEV positieve faecessuspensie en het murine norovirus lysaat waarvan de concentraties geschat zijn op ongeveer 9 log RNA kopijen/ml. De bekomen concentraties liggen in dezelfde grootteorde als de te verwachten concentraties.

In een laatste stap worden varkensleverstalen beënt met humaan HEV positieve faecessuspensie en murine norovirus lysaat. Het virus wordt vervolgens geconcentreerd volgens een protocol gebaseerd op het standaardprotocol van Wageningen bioveterinary research. Hierna wordt RNA geëxtraheerd, cDNA bereid en qPCR uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Door vergelijking van het aantal gedetecteerde genomische kopijen met het aantal beënte wordt er een besluit getrokken over het verloop van het volledige proces. 

Bibliografie

S. D. d. M. R. A. M. C. B. A. v. H. P. W. W. d. E. A. A. Pas, „Hepatitis E Virus Infection among Solid Organ Transplant Recipients, the Netherlands,” Emerging Infectious Diseases, nr. 18, pp. 869-872, 2012.

A. Stals, L. Baert, N. Botteldoorn, H. Werbrouck, L. Herman, M. Uyttendaele en E. Van Coillie, „Multiplex real-time RT-PCR for simultaneous detection of GI/GII noroviruses and murine norovirus1,” in Molecular detection of noroviruses in ready-to-eat foods and fruit products, 2009, pp. 247-253.

„de vlaamse overheid,” mei 2015. [Online]. Available: http://lv.vlaanderen.be/nl/home/over-ons/instituut-voor-landbouw-visser…. [Geopend maart 2017].

„RIVM De zorg voor morgen begint vandaag,” Rijksinstituut voor Violksgezondheid en Milieu, 6 maart 2017. [Online]. Available: http://www.rivm.nl/Documenten_en_publicaties/Algemeen_Actueel/Veelgeste…. [Geopend maart 2017].

„geef virussen in voeding geen kans,” federale overheidsdienst volsgezondheid, veiligheid van de voedselketen en leefmilieu, 7 maart 2016. [Online]. Available: http://www.health.belgium.be/nl/voeding/voedselveiligheid/microbiologis…. [Geopend maart 2017].

N. H. Centrum, „wat is hepatitis A? algemene informatie,” Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu , mei 2013. [Online]. Available: http://www.rivm.nl/dsresource?objectid=c298cb13-f28a-48cc-8287-0328de84…. [Geopend maart 2017].

R. v. V. e. Milieu, „Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu,” mei 2013. [Online]. Available: http://www.rivm.nl/dsresource?objectid=a4963105-0553-4577-8809-0c27b16d…. [Geopend maart 2017].

J. Izopet, „Zoonotic Hepatitis E virus: Classification, Animal Reservoirs and transmission Routes,” Viruses, vol. 8, nr. 270, p. 24, 2016.

„Het hepatitis E virus bij het varken: een zoönose?,” Vlaams Diergeneeskundig, nr. 79, p. 7, 2010.

F. Tacke, „Medscape,” Future virology, 2009. [Online]. Available: http://www.medscape.com/viewarticle/589933_2. [Geopend maart 2017].

Hindawi Publisging Corporation, „Hepatitis E virus in Industrialized Countries: The silent Threat,” BioMed Reseach International, p. 17, 2016.

M. D. Boulle, 2012. [Online]. Available: http://lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/001/892/824/RUG01-001892824_2012_0001…. [Geopend maart 2017].

H. Dalton R. en J. Seghatchian, „Hepatitis E virus: Emerging from the shadows in developed countries,” Transfusion and apheresis science, nr. 55, p. 4, 2016.

E. Slok, „LCI-richtlijn Hepatitis E,” rijksinstituut voor volksgezondheid en milieu, 26 april 2016. [Online]. Available: http://www.rivm.nl/Documenten_en_publicaties/Professioneel_Praktisch/Ri…. [Geopend maart 2017].

N. Kamar, H. R. Dalton, F. bravanel en J. Izopetb, „Hepatitis E Virus Infection,” NCBI, 27 januari 2014. [Online]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3910910/. [Geopend maart 2017].

thermo fisher scientific, „Protein Biology Resource Library,” [Online]. Available: https://www.thermofisher.com/be/en/home/life-science/protein-biology/pr…. [Geopend maart 2017].

Bio-Rad Laboratories, „ELISA Detection Options,” BIO-RAD, 2017. [Online]. Available: ttps://www.bio-rad-antibodies.com/elisa-detection-direct-indirect.html. [Geopend maart 2017].

E. Pommereau, „Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid (WIV),” 1 februari 2017. [Online]. Available: https://www.wiv-isp.be/nl/gezondheidsonderwerpen/hepatitis/preventie. [Geopend maart 2017].

N. Cook, „Survival and elimantion of hepatitis E virus: A Review,” Food Environ virol, vol. 7, p. 5, 2015.

microtissues, „Driedimensionale (3D) Cell Culture versus Twee dimensionale (2D) Cell Culture,” sigma-aldrich, [Online]. Available: https://translate.google.be/translate?hl=nl&sl=en&tl=nl&u=http%3A%2F%2F…. [Geopend maart 2017].

W. van der Poel, „Hepatitis E Virus,” Emerging Zoonotic Viruses, [Online]. Available: http://www.wimvanderpoel.nl. [Geopend mei 2017].

E. Parafragkou en M. Kulka, „Review: Approaches to the viral extraction, detection and identification of hepatitis viruses, HAV and HEV, in foods,” Food biological contaminants, vol. 1, nr. 99, pp. 130-142, 2016.

J. Vandesompele, „Eurogentec,” 2017. [Online]. Available: http://www.eurogentec.com. [Geopend april 2017].

S. Martin Latil, C. Hennechart-Collette, L. Guillier en S. Perelle, „Duplex RT-qPCR for the detection of hepatitis E virus in water, using a process control,” International Journal of Food Microbiology, nr. 157, pp. 167-173, 2012.

N. Jothikumar, T. L. Cromeans, B. H. Robertson, X. Meng en V. R. Hill, „A broadly reactive one-step real-time RT-PCR assay for rapid and sensitive detection of hepatitis E virus,” Journal of Virological Methods, nr. 131, pp. 65-71, 2006.

A. Stals, L. Baert, E. Van Coillie en M. Uyttendaele, „Evaluation of a norovirus detection methodology for soft red fruits,” in Molecular detection of noroviruses in ready-to-eat foods and fruit products, 2010, pp. 52-58.

S. Martens, Rapporteren voor technici, 1ste red., Leuven: Acco, 2016.

A. Boeykens, „Handleiding papers en bachelorproef,” Odisee, Gent, 2017.

„Hepatitis info,” 25 oktober 2016. [Online]. Available: http://www.hepatitisinfo.nl/kennisbank/Aandoening.E/aDU1235_Hepatitis-E…. [Geopend maart 2017].

Qiagen, „Rneasy Mini Handbook,” juni 2012. [Online]. Available: https://www.qiagen.com/es/resources/resourcedetail?id=14e7cf6e-521a-4cf…. [Geopend april 2017].

ThermoFisher Scientific, „Reverse Transcription—Six Most Common Applications,” [Online]. Available: http://www.thermofisher.com/be/en/home/life-science/cloning/cloning-lea…. [Geopend april 2017].

A. KUumar, „TaqMan Assay Vs SYBR Green Assay,” Bio-resource , 20 mei 2013. [Online]. Available: http://technologyinscience.blogspot.be/2013/05/taqman-assay-vs-sybr-gre…. [Geopend april 2017].

M. Williams, „Sciencing,” Leaf Group Ltd, 2017. [Online]. Available: http://sciencing.com/magnesium-chloride-used-pcr-5390976.html. [Geopend april 2017].

ThermoFisher Scientific, „TaqMan® Universal PCR Master Mix,” Applied biosystems, 2017. [Online]. Available: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4304437. [Geopend april 2017].

Universiteit of Hogeschool
Professionele bachelor Chemie afstudeerrichting Biochemie
Promotor(en)
dr. ir. Els Van Coillie
Kernwoorden
Share this on: