The effect of cold atmospheric plasma on biofilms developed by L. monocytogenes and S. Typhimurium
Een biofilm is een samenleving van bacteriën die omgeven is door een extracellulaire matrix die bescherming biedt tegen verschillende omgevingsfactoren. Biofilms zijn een significant probleem in de voedingsindustrie waar ze kunnen voorkomen op omgevingsoppervlakken (vb. muren en vloeren), oppervlakken die direct in contact staan met voeding (vb. transportbanden) en op het oppervlak van de voedingsproducten zelf. Wanneer een biofilm aanwezig is, kan deze aanleiding geven tot contaminatie van voedingsproducten met bederfbacteriën en/of pathogene bacteriën. Wanneer het eindproduct met deze bacteriën besmet zou zijn, kan dit respectievelijk aanleiding geven tot economische verliezen en/of risicovol zijn voor de volksgezondheid.
Het verwijderen van deze biofilms is echter niet eenvoudig wegens het beschermend effect van de extracellulaire matrix. Conventionele methoden maken gebruik van oxiderende chemicaliën, zoals perazijnzuur of natriumhypochloriet, en zijn veelal onvoldoende efficiënt. Daarnaast brengt het gebruik van chemicaliën nog enkele andere nadelen met zich mee, zoals corrosie, toxiciteit, residuen die kunnen achterblijven, het gebruik van water, en het species-specifieke karakter. Het gebruik van actieve chloor (natriumhypochloriet) kan bijvoorbeeld corrosie teweegbrengen en is efficiënter tegen gramnegatieve dan tegen grampositieve bacteriën. Door deze nadelen worden er nieuwe technologieën onderzocht voor de verwijdering van biofilms, zoals het gebruik van koud atmosferisch plasma (KAP).
Koud atmosferisch plasma is een geïoniseerd gas, bestaande uit reactieve deeltjes zoals ionen, elektronen, reactieve zuurstof- en stikstofverbindingen en UV-fotonen. De ionisatie van het gas wordt in dit onderzoek tot stand gebracht met behulp van elektrische ontlading. Deze ontlading wordt gerealiseerd door een alternerende stroom met een hoge frequentie en een hoog voltage over een elektrode te sturen.
In deze thesis werden twee types elektroden getest, de ‘dielectric-barrier discharge’ (DBD) en de ‘surface barrier discharge’ (SBD) elektrode. Naast het effect van het type elektrode op de inactivatie van biofilms werd ook de gassamenstelling bestudeerd. Hierbij werden puur heliumgas en twee mengsels van heliumgas met zuurstof (He + 0,5/1,0% (v/v) O2) getest. Het gas werd bij ieder experiment geïoniseerd bij een inputvoltage van 13,88 V en een frequentie van 15 kHz. Iedere combinatie van elektrode en zuurstofpercentage werd uitgetest op biofilms ontwikkeld door zowel Listeria monocytogenes als door Salmonella Typhimurium. Dit zijn twee belangrijke voedselpathogenen omwille van de hoge abundantie van Salmonella en de hoge letaliteit van Listeria (monocytogenes).
De invloed van de behandelingstijd werd nagegaan door 10 behandelingstijden te hanteren binnen een bereik van 0 tot 30 minuten. Deze behandelingstijden werden voor iedere combinatie van elektrode en zuurstofpercentage getest. Na de behandeling met KAP werden de cellen in de behandelde biofilm teruggewonnen (met behulp van een celschraper) en vervolgens verdund volgens een decimale verdunningsreeks. Iedere verdunning werd uitgeplaat op een selectief en een niet-selectief medium, zodat het percentage van subletaal verwonde cellen kon bepaald worden. De resultaten van de tellingen werden vervolgens gefit met het primair predictief schouder-staart type inactivatie model dat ontwikkeld werd door Geeraerd et al. (2000).
De inactivatiecurves die werden verkregen door de resultaten te fitten met het model van Geeraerd et al. (2000) vertoonden geen schouderfase, maar wel steeds een staartfase. De afwezigheid van de schouderfase impliceert dat vanaf het moment dat de behandeling gestart wordt, er inactivatie/beschadiging van cellen in de biofilm plaatsvindt. De aanwezigheid van de staart toont de aanwezigheid aan van een subpopulatie die meer resistent is tegen de KAP-behandeling.
De resultaten wezen eveneens uit dat het effect van het gebruik van verschillende elektroden op de efficiëntie van de KAP-behandeling afhankelijk is van de gebruikte gassamenstelling. Zo werd er gevonden dat wanneer er puur heliumgas gebruikt wordt, de DBD-elektrode efficiënter is (doordat er hogere reducties verkregen werden, of een eenzelfde reductie sneller behaald werd). Echter, wanneer er heliumgas werd gebruikt met 0,5% of 1,0% (v/v) zuurstof, dan werd er geen uniforme trend waargenomen. Voor de invloed van het type voedingsgas op de efficiëntie van de KAP-behandeling kon echter een semi-uniform verband vastgesteld worden. Over het algemeen bleek namelijk dat het gebruik van puur heliumgas tot hogere reducties leidt dan wanneer er 0,5% of 1,0% (v/v) zuurstof werd toegevoegd. Echter, bij het gebruik van deze laatste twee gassamenstellingen werden geen significante verschillen bekomen wanneer de SBD-elektrode werd gebruikt en in het geval van de DBD-elektrode, werden er tegenstrijdige resultaten bekomen. Er werden namelijk hogere reducties bekomen voor S. Typhimurium biofilms wanneer de DBD-elektrode werd gebruikt in combinatie met heliumgas met 0,5% (v/v) zuurstof, in vergelijking met wanneer heliumgas met 1,0% (v/v) zuurstof werd gebruikt, terwijl het omgekeerde waargenomen werd bij behandeling van L. monocytogenes biofilms onder dezelfde omstandigheden.
De meest efficiënte behandelingen werden bijgevolg verkregen wanneer de DBD-elektrode gebruikt werd met puur helium gas. Bij gebruik van deze combinatie werden voor de S. Typhimurium en L. monocytogenes biofilms log10-reducties behaald van respectievelijk 2,4 ± 0,2 en 2,3 ± 0,2, en dit voor beiden binnen een behandelingstijd van 5 minuten. Deze behaalde log10-reducties zijn echter niet hoog genoeg om voedselveiligheid te kunnen garanderen. Aan de positieve kant, de finale (relatief lage) reducties worden snel behaald. Op industriële schaal komt dit neer op korte periodes van ‘equipment downtime’. Vooraleer deze technologie echter gerealiseerd kan worden op industriële schaal, moeten er hogere log10-reducties behaald worden. Om deze hogere reducties te bekomen, kunnen er bijvoorbeeld hogere voltage levels getest worden. Daarnaast zou het ook mogelijk zijn om eventuele voor- en/of nabehandeling te implementeren (bv. een voorbehandeling met een verdunde waterstofperoxide oplossing).
Dat een gelijkaardige log10-reductie bekomen werd voor de S. Typhimurium en L. monocytogenes biofilm, onder de bovenstaande condities, suggereert dat onder deze condities de KAP-behandeling even efficiënt is tegen grampositieve (L. monocytogenes) en gramnegatieve (S. Typhimurium) species. Om deze indicatie te bevestigen moeten er echter een grotere variatie aan grampositieve en gramnegatieve species getest worden.
Aan de hand van de resultaten van het subletaal letsel kon vastgesteld worden dat er reeds subletaal verwonde cellen aanwezig zijn in een biofilm alvorens de behandeling gestart werd. Gedurende de behandeling kon een algemene trend van het percentage subletaal letsel in functie van de behandelingstijd vastgesteld worden, namelijk een stijging gevold door een maximum, waarna terug een daling plaatsvond tot een residuele waarde bereikt werd. Deze trend suggereert een mechanisme van accumulatie aan subletale letsels, die vervolgens leidt tot celdood (Noriega et al., 2013). Tussen het gebruik van verschillende elektroden en het gebruik van de DBD-elektrode in combinatie met de verschillende types geteste voedingsgassen, zijn de resultaten met betrekking tot de subletale letsels niet eenduidig. Echter, bij het gebruik van de SBD-elektrode in combinatie met de verschillende geteste voedingsgassen kon er wel een verband vastgesteld worden. Met deze elektrode werd namelijk het hoogste residuele percentage aan subletaal letsel bekomen bij het gebruik van helium met een additie van 0,5% (v/v) zuurstof, gevolgd door het residuele percentage bij gebruik van puur heliumgas, en de laagste residuele waarde werd bekomen wanneer helium gas met een additie van 1,0% (v/v) zuurstof gebruikt werd. Ten slotte dient vermeld te worden dat deze subletaal verwonde cellen niet over het hoofd gezien mogen worden aangezien deze cellen mogelijks kunnen herstellen van hun letsels (na de behandeling met KAP) en daarom nog steeds een gevaar vormen voor de volksgezondheid.
