Validatie van een kwantitatieve screeningsmethode voor 7 beta-blokkers in bloed met behulp van LC-MS/MS

Flo Elsen
Screening is de eerste stap in het toxicologische proces. Het wordt gebruikt om de componenten te identificeren die aanwezig zijn in het staal. Screening is een kwalitatieve methode, bijgevolg kan het slechts een indicatie geven over welke stoffen aanwezig of afwezig zijn in het staal, en moet het bevestigd worden door een bevestigingstest. Een nadeel van deze bevestigingstesten is dat ze tijdrovend zijn. Ook zijn deze bevestigingstesten arbeidsintensief en duur.
In dit onderzoek, wordt een kwantitatieve screeningsmethode voor zeven β - blokkers in bloed met gebruik van LC - MS/MS gevalideerd. Een kalibratiecurve met matrix-matchende stalen werd geconstrueerd voor elke β - blokker. Deze kalibratiecurve omvat het hele therapeutische bereik en lage toxische bereik. Accuraatheid en precisie resultaten voldeden aan de voorgestelde criteria, behalve voor nebivololol en propranolol. Bij het gebruik van de methode in de praktijk moet er rekening mee worden gehouden dat er voor deze twee analyten een bepaalde foutmarge op het resultaat bestaat. Matrixeffecten waren binnen een bereik van 105%-143% en opbrengsten binnen een bereik van 6%-15%. Stabiliteitstesten concludeerden dat de β - blokkers stabiel blijven gedurende het hele analytische proces, wat belangrijk is voor de kwantificering. Na validatie werden vijf zaken, met indicatie van β-blokkers, getest om de concentratie van de β-blokker te bepalen en om na te gaan of de concentratie binnen het therapeutisch bereik of bij een toxische of dodelijke concentratie lag.

Methode validatie; onmisbaar in de wetenschap

Stel  u voor, uw echtgeno(o)t(e) overlijdt. U wordt onterecht in verdenking gesteld voor vergiftiging. Dan mag u hopen dat de onderzoeksresultaten feilloos zijn. Gevalideerde onderzoeksmethodes zijn daarom voor ons allemaal van essentieel belang.

De thesis die ik geschreven heb in het labo van Toxicologie en Farmacologie van de KU Leuven, gaat over methode validatie, en meer specifiek de validatie van een methode om beta-blokkers in bloed op te sporen. Beta-blokkers zijn medicatie waar we vroeg of laat allemaal mee in contact komen.

In dit artikel neem ik u in begrijpbare taal mee doorheen de hoofdlijnen van mijn scriptie.

Eerst en vooral wil ik het hebben over toxicologie. Toxicologie is de studie van (ongewenste) effecten van chemische substanties op een organisme. Forensische toxicologie kan verheldering bieden in postmortem zaken die het resultaat zijn van homocidale, suïcidale of accidentele intoxicaties (vergiftiging). Ook kan het opheldering geven in antemortem zaken, zoals seksuele geweldpleging waarbij het slachtoffer gedrogeerd werd en bij het nagaan van abstinentie van alcohol- of drugsverslaafden.

De volgende vragen, gerelateerd aan intoxicatie, staan centraal in het toxicologisch onderzoek:

  • Werd het slachtoffer vergiftigd?
  • Welk gif werd er toegediend?
  • Was de toegediende hoeveelheid gevaarlijk of lethaal?

Om deze vragen te beantwoorden zijn er kwalitatieve (welke substantie is aanwezig) en kwantitatieve (hoeveel van deze substantie is er aanwezig) analyses nodig. Deze analyses worden in het toxicologisch labo ontwikkeld.

Methode validatie is een belangrijk onderdeel bij deze methode ontwikkeling en van elk ander wetenschappelijk onderzoek. Indien de methode die je gebruikt om het onderzoek uit te voeren niet gevalideerd is, kan er nooit bewezen worden of het bekomen resultaat wel degelijk correct is. We hernemen even het voorbeeld waarmee ik dit artikel gestart ben. Uw echtgeno(o)t(e) sterft plotseling. U wordt verdacht van het vergiftigen van haar/hem met stof x. Echter deze stof x komt ook natuurlijk voor in het lichaam. Om dit te controleren gebruikt men een ‘cut-off’ waarde. Als het bekomen resultaat hoger is dan de ‘cut-off’ waarde, dan kan men met zekerheid zeggen dat deze stof extern werd toegediend. Stel nu het forensische laboratorium ontwikkelt een methode om stof x te kunnen detecteren en kwantificeren. Het resultaat van de methode geeft aan dat de hoeveelheid van stof x boven de ‘cut-off’ waarde ligt en dat stof x extern werd toegediend. Hierdoor wordt u beschuldigd voor vergiftiging van uw echtgeno(o)t(e) en krijgt u een gevangenisstraf van 3 jaar met een boete van 300 euro. Achteraf blijkt dat het forensisch laboratorium de gebruikte opsporingsmethode niet gevalideerd heeft. Bij nieuw onderzoek met een gevalideerde methode blijkt dat de correcte hoeveelheid van stof x in het lichaam van uw echtegeno(o)t(e) eigenlijk onder de ‘cut-off’ waarde ligt en er helemaal geen sprake is van externe toediening. U werd dus veroordeeld voor iets dat u helemaal niet gedaan heeft. Zo zie je hoe in deze context methode validatie heel belangrijk is. Immers kunnen foute resultaten grote gevolgen hebben voor de verdachte, maar ook voor het slachtoffer. Dit was een denkbeeldig voorbeeld, maar heeft zich in werkelijkheid al wel voorgedaan.

Methode validatie bestaat uit verschillende onderdelen, nl

  • Selectiviteit: de mate waarin andere stoffen in de matrix (in dit geval in het bloed) de bepaling van de stof verstoren.
  • Kwantificatielimiet: mate van gevoeligheid van de methode.
  • Accuraatheid: het verschil tussen de voorspelde waarde en de theoretische waarde
  • Precisie: de mate van overeenstemming tussen een reeks metingen
  • Matrix-effecten: de mate waarin andere stoffen in de matrix het analyse resultaat veranderen
  • Opbrengst: tijdens de analyse kan er een deel van de stof verloren gaan, hierdoor veranderd de uitkomst. Een goede methode heeft dus een hoge opbrengst.
  • Stabiliteit: Indien de stof afbreekt in het bloed, kan men deze stof ook niet onderzoeken. Hierdoor is het belangrijk dat de stabiliteit van de stof onderzocht wordt.

Ik kan deze onderdelen in detail uitleggen en hoe ik dit bestudeerd heb, maar dit zal ons te ver leiden van de essentie van dit artikel.

In mijn thesis heb ik gekozen een methode te valideren om beta-blokkers te kunnen kwantificeren. Beta-blokkers worden gebruikt voor de behandeling van hartfalen, angina, hoge bloeddruk, hartkloppingen etc. Ook kunnen ze helpen bij de behandeling van migraine, tremor, glaucoom etc. Beta-blokkers zijn dus geen recreationele drugs zoals cocaïne of XTC, maar dit betekent niet dat er geen misbruik kan zijn van beta-blokkers. Door hun hartslag verlagende en tremor verminderende activiteit worden ze vaak misbruikt in de sportwereld waar stabiliteit en accuraatheid vereist zijn, zoals bij boogschieten of biljarten. Daarom zijn beta-blokkers ook opgenomen in de verboden lijst van het wereld anti-dopingsagentschap (WADA).

Waarom beta-blokkers? Ten eerste; in het labo van Toxicologie en Farmacologie van de KU Leuven, hadden ze nog geen methode om beta-blokkers te kunnen kwantificeren. In dit labo werden de laatste drie jaar in ongeveer 1 van de 8 gevallen beta-blokkers teruggevonden. Dit wil zeggen dat de nood aan een methode om beta-blokkers te kwantificeren hoog was. Een andere reden is het stijgend gebruik van beta-blokkers door de stijging van hart- en vaatziekten.

Ik heb gedurende mijn onderzoek een volledige methode om beta-blokkers te kwantificeren kunnen valideren. Bij gebruik van deze methode in de praktijk, moet men er rekening mee houden dat sommige beta-blokkers afwijkingen vertonen in accuraatheid en precisie. Dit zal resulteren in een bepaalde foutenmarge op het resultaat. Omdat deze methode enkel zal gebruikt worden als indicatie, vormen deze lagere accuraatheid en precisie geen probleem. Ondanks deze nadelen blijven de onderzochte beta-blokkers stabiel en kan de methode een goed predictie maken van de hoeveelheid aanwezig in het bloedstaal. Bijkomend is het ook een snelle en makkelijke methode waarbij ‘high throughput’ mogelijk is.

Tot slot hoop ik dat het voor u duidelijk is geworden dat methode validatie onmisbaar is in het forensische labo en in wetenschappelijk onderzoek in het algemeen.

Bibliografie

1. Drummer OH. Forensic Toxicology. Exp Suppl. 2010;100:579–603.
2. Dinis-Oliveira RJ, Carvalho F, Duarte JA, Remião F, Marques A, Santos A, et al. Collection of biological samples in forensic toxicology. Toxicol Mech Methods. 2010;20(7):363–414.
3. Maurer HH. Analytical Toxicology. Exp Suppl. 2010;100:317–37.
4. Oostveen MI, Oosting R, Smink BE. Haaranalyse door het Nederlands Forensisch Instituut bij het vermoeden van een aan drug of geneesmiddel gerelateerd misdrijf. 2011;5:187–92.
5. Souverain S, Rudaz S, Veuthey JL. Protein precipitation for the analysis of a drug cocktail in plasma by LC-ESI-MS. J Pharm Biomed Anal. 2004;35(4):913–20.
6. Polson C, Sarkar P, Incledon B, Raguvaran V, Grant R. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removel and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2003;785:263–75.
7. Ho, CS; Lam, CWS; Chan, MHM; Cheung, RCK; Law, LK; Lit, LCW; Ng, KF; Suen M and TH. Electrospray Ionisation Mass Spectrometry: Principles and Clinical Applications. Clin Biochem Rev [Internet]. 2003;24(February):3–12.
8. Harris D c. Quantitative Chemical Analysis - 7th Edition. Vol. 42, New York. 2007. 1008 p.
9. Pitt JJ. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. Clin Biochem Rev. 2009;30(1):19–34.
10. Verplaetse R, Decabooter S, Cuypers E, Tytgat J. Screening of Urine and Blood Using Limited Sample Preparation and Information Dependent Acquisition with LC-MS/MS as Alternative for Immunoassays in Forensic Toxicology. J Forensic Toxicol Pharmacol. 2013;02(2):1–8.
11. Gorre F, Vandekerckhove H. Beta-blockers: Focus on mechanism of action which beta-blocker, when and why? Acta Cardiol. 2010;65(5):565–70.
12. Khalid MM, Hamilton RJ. Beta-Blocker Toxicity Pathophysiology Treatment / Management. 2018;1–3.
13. Davis E, Loiacono R, Summers RJ. The rush to adrenaline: Drugs in sport acting on
II
the β-adrenergic system. Br J Pharmacol. 2008;154(3):584–97.
14. The World Anti-Doping Code. The 2018 Prohibited List International Standard. 2018;(JANUARY). Available from: https://www.wada-ama.org/en/content/what-is-prohibited
15. Steenen SA, Van Wijk AJ, Van Der Heijden GJMG, Van Westrhenen R, De Lange J, De Jongh A. Propranolol for the treatment of anxiety disorders: Systematic review and meta-analysis. J Psychopharmacol. 2016;30(2):128–39.
16. Adhi Sharma M. Beta-Blocker Toxicity. 2018;11–3.
17. Graudins A, Lee HM, Druda D. Calcium channel antagonist and beta-blocker overdose: Antidotes and adjunct therapies. Br J Clin Pharmacol. 2016;81(3):453–61.
18. EMA. Guideline on bioanalytical method validation. 2012;44(July 2011):1–23.
19. Peters FT, Drummer OH, Musshoff F. Validation of new methods. Forensic Sci Int. 2007;165(2–3):216–24.
20. Polettini A. Applications of LC-MS in Toxicology. In: Pharmaceutical Press. 2006. p. 71–96.
21. Remane D, Meyer MR, Wissenbach DK, Maurer HH. Ion suppression and enhancement effects of co-eluting analytes in multi-analyte approaches : systematic investigation using ultra-high-performance liquid chromatography / mass spectrometry with atmospheric- pressure chemical ionization or electrospray ion. 2010;3103–8.

Universiteit of Hogeschool
Master in de toegepaste biomedische wetenschappen: minor forensische biomedische wetenschappen
Publicatiejaar
2019
Promotor(en)
Prof. Eva Cuypers
Kernwoorden
Share this on: