Ontwikkeling en optimalisatie van microsatellietmerkes voor het Heideblauwtje (Plebejus argus)

Melissa Claus
In deze studie verricht men genetisch onderzoek op het Heideblauwtje in Vlaanderen. Dit onderzoek kadert binnen het behoud van de biodiversiteit en van bedreigde soorten in Vlaanderen.

Fladdert het Heideblauwtje een onzekere toekomst tegemoet?

Het Instituut voor Natuur- en Bosonderzoek (INBO) heeft recentelijk een onderzoek opgestart rond de genetische diversiteit van het Heideblauwtje. Deze studie kadert binnen het behoud van de biodiversiteit en van bedreigde soorten in Vlaanderen. Of de achteruitgang van de heidegebieden, door onder andere landbouwintensivering, een impact heeft op de toestand van de genetische diversiteit van populaties kan middels dit onderzoek aangetoond worden. 

Bedreigde vlinderpopulaties

Het Heideblauwtje is een dagvlinder die in heidegebieden leeft en wordt gekenmerkt door een beperkte mobiliteit van maximaal enkele kilometers. Door deze beperkte mobiliteit en door hun versnipperde leefgebied vormt deze soort sterk geïsoleerde populaties en kunnen ze moeilijker nieuwe gebieden koloniseren. De kans op achteruitgang van deze soort is daarom groot. Bovendien zijn ze afhankelijk van specifieke plantensoorten om zich voort te planten. 

In deze studie wordt een methode ontwikkeld om zowel huidige als historische populaties te onderzoeken op hun genetische diversiteit op basis van DNA-analyses. Dit zal meer inzicht geven over hoe het tot op de dag van vandaag gesteld is met het Heideblauwtje. 

DNA verzamelen 

Eind juni 2018 werden verscheidene vlinderpopulaties bemonsterd op een aantal plaatsen in Vlaanderen. Voor de historische populaties werd er beroep gedaan op museumstalen, bestaande uit opgepinde vlindercollecties die opgeslagen en bewaard worden in het Koninklijk Belgisch Instituut voor Natuurwetenschappen (KBIN). Deze stalen vertegenwoordigen populaties van de periode 1938 – 1950, toen de heidegebieden nog veel uitgebreider waren en er minder pesticiden werden gebruikt in de landbouw. Deze periode was veel gunstiger voor de vlinderpopulaties. Indien de afname van de heideoppervlakte en de intensivering van de landbouw een negatieve impact heeft gehad op de populaties, verwachten we een hogere genetische diversiteit in de historische populaties ten opzichte van de genetische diversiteit in de recente populaties. 

De bemonstering gebeurt als volgt: bij elke vlinder wordt met behulp van een pincet een stukje vleugel verwijderd waarin mogelijk DNA aanwezig is. De vlinders ondervinden hiervan geen leed en worden nadien terug vrijgelaten in de natuur. 

Alvorens het DNA kan onderzocht worden in het laboratorium moet het eerst geïsoleerd worden.  Het DNA moet namelijk zuiver zijn en vrijgesteld worden van allerlei andere onzuiverheden. Museumstalen zijn nogal gevoelig voor besmetting waardoor het noodzakelijk is om een extra opzuivering uit te voeren. Het DNA van deze vlinders is vaak grotendeels afgebroken tot kleine stukjes en de hoeveelheid DNA aanwezig in de stalen is heel erg laag. Daarom worden bepaalde laboratoriumtechnieken in een ‘’cleanroom’’ uitgevoerd die een zeer zuivere werkomgeving biedt en waar onder zeer steriele omstandigheden kan worden gewerkt. 

Ontwikkelen en optimaliseren van microsatellietmerkers 

Om de studie naar de genetische diversiteit aan te vatten, zijn er geschikte moleculaire merkers vereist, zoals microsatellietmerkers. Deze merkers, bestaande uit korte stukjes DNA, werden specifiek ontwikkeld voor het Heideblauwtje. Bovendien zijn ze geschikt om hele lage hoeveelheden van erfelijk materiaal te onderzoeken. 

Vertrekkend van 500 mogelijke primers (kleine stukjes DNA), werden 72 primers geselecteerd en getest op hun bruikbaarheid voor een populatiegenetische studie van het Heideblauwtje. Uit de resultaten kon vastgesteld worden dat 12 primers geschikt zijn voor microsatelliet analyses op huidige stalen maar ook op museumstalen. De primers werden geoptimaliseerd en kunnen toegepast worden op de bemonsterde stalen van het Heideblauwtje. 

Aangezien er met kleine hoeveelheden DNA wordt gewerkt is het nodig om het DNA te gaan vermenigvuldigen, met behulp van PCR (polymerisatiekettingreactie), om het te kunnen analyseren. PCR is een laboratoriumtechniek dat gebruikt wordt om een natuurlijk proces in de cel na te bootsen, namelijk het vermenigvuldigen van het DNA tijdens de celdeling waarbij oude cellen worden vervangen door nieuwe cellen. 

Het vermenigvuldigingsproces bestaat uit drie stappen die een aantal keer worden herhaald. Eerst wordt het gewenste stukje DNA (amplicon), bestaande uit twee strengen, gesplitst in twee enkele strengen. Vervolgens bindt zich een complementaire primer aan beide DNA-strengen. Als laatste stap zal een bepaald eiwit de nieuwe DNA-streng, die complementair is aan de gesplitste DNA-strengen, verder aanmaken. Bij elke cyclus is er een exponentiële vermenigvuldiging van het amplicon en op die manier wordt een bruikbare hoeveelheid aan DNA bekomen. 

Om tot individuele genetische profielen te komen is een scheiding van DNA-fragmenten noodzakelijk. De scheiding en detectie gebeurt door middel van capillaire elektroforese. Het DNA, dat altijd negatief geladen is, migreert door een aangelegd elektrisch veld doorheen een capillair (buisje met kleine diameter) van de negatieve pool naar de positieve pool. De kleinste fragmenten migreren het snelst en zullen bijgevolg als eerste gedetecteerd worden. De waarnemingen worden omgezet in piekenpatronen die de individuele genetische profielen van de vlinders zullen weergeven.  

Resultaat

De 12 ontwikkelde en geoptimaliseerde microsatellietmerkers kunnen gebruikt worden als genetische merkers op recente en historische populaties van het Heideblauwtje. 

De verkregen genetische profielen vormen de basis voor de studie naar genetische verschillen tussen individuen en populaties. Uit deze studie kan er afgeleid worden of de historische populaties er destijds beter aan toe waren of dat deze populaties meer genetische diversiteit bevatten dan de huidige geïsoleerde populaties. 

Dergelijk genetisch onderzoek zal enerzijds toelaten de huidige en historische genetische diversiteit in kaart te brengen en anderzijds inzicht te krijgen in de ecologie van de soort; een noodzaak voor het opstellen van wetenschappelijk onderbouwde beheersmaatregelen ter behoud van het Heideblauwtje in Vlaanderen. 

 

 

image 300image 27

Figuur 1. Mannetje Heideblauwtje (Dirk Maes, 2018)

image 301

Figuur 2. Vleugelstukje genomen bij een recent mannetje Heideblauwtje op de Sonnisheide in Houthalen-Helchteren (Dirk Maes, 2018) 

 

image 302

Figuur 3. Heideblauwtjes (historische populaties) van het KBIN.

image 303

Figuur 4. Vleugelstukje genomen bij een historisch Heideblauwtje in een cleanroom. 

Bibliografie

AG Scientific. (2018, 26 maart). 10 Questions you want to ask about proteinase K. Geraadpleegd op 28 januari 2019, beschikbaar op http://agscientific.com/blog/2018/03/proteinase-k-faqs/

AllGenetics. (z.d.). Experts in microsatellite genotypering – AllGenetics. Geraadpleegd op 20 januari 2019, beschikbaar op https://www.allgenetics.eu/index.php/services/genomics-for- researchers/microsatellite-genotyping.html

BAKER - Enviroments For Science. (2017, oktober). The effectiveness of HEPA filters on DNA [PDF]. Geraadpleegd op 22 februari 2019, beschikbaar op http://files.massbio.org/file/XleEwhv.zp8vqG9I0jj.1.pdf

Benchling, (z.d.). Protocols – Benchling. Geraadpleegd op 22 maart 2019, beschikbaar op https://benchling.com/protocols/GP1fQ08o/pcr-amplification-of-gfp/sbs

Bio-Rad. (z.d.). InstGeneTM Matrix / Life Science Research / Bio-Rad. Geraadpleegd op 23 januari 2019, beschikbaar op http://www.bio-rad.com/en-be/product/instagene- matrix?ID=6c2be54f-6c95-43de-8ce3-e9aee8229eeb

Butler, J.M. et al., (2010). Fundamentals of Forensic DNA typing. Geraadpleegd op 22 maart 2019, beschikbaar op https://books.google.be/books?id=- OZeEmqzE4oC&printsec=frontcover&hl=nl&source=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage& q&f=false

De Jong, R. (1995, februari). Het Heideblauwtje – Vlinders. Geraadpleegd op 19 januari 2019, beschikbaar op http://natuurtijdschriften.nl/download?type=document;docid=557968

De polymerasekettingreactie in de klas (2005). [PDF]. (z.d.). Geraadpleegd op 12 maart 2019, beschikbaar op https://wet.kuleuven.be/wetenschapinbreedbeeld/lesmateriaal_biologie/le… ntekst.pdf

De Vries et al., (2017, juli). Wild van Vlinders – Herstelplan voor dagvlinders in Zuidoost- Nederland [PDF]. Geraadpleegd op 19 januari 2019, beschikbaar op https://www.ark.eu/sites/default/files/media/Vlinder/Herstelplan_Dagvli…

Forensic Bioinformatics. (z.d.). Possible Issues with DNA Evidence. Geraadpleegd op 10 maart 2019, beschikbaar op http://www.bioforensics.com/dna-testing-issues/

Instituut Natuur- en Bosonderzoek. (z.d.). Genetische Diversiteit - Medewerkers - INBO Expert Portal. Geraadpleegd op 9 januari 2019, beschikbaar op https://pureportal.inbo.be/portal/nl/organisations/genetic-diversity(0312ebbe-a38e-49cd- 82c6-ab79daa84bd1)/persons.html

Instituut Natuur- en Bosonderzoek. (2017). Strategische Meerjarenplanning 2014-2019 [PDF]. Geraadpleegd op 9 januari 2019, beschikbaar op https://drive.google.com/drive/folders/1K2hhPsFAxSdreheFeM0PrYs8Ju-IKVat

Maes D, Vanreusel W, Van Dyck H (2013). Dagvlinders in Vlaanderen: nieuwe kennis voor betere actie. Uitgeverij Lannoo nv, Tielt. 542 pp.

McKiernan, H.E., & Danielson, P.B. (2017). Phenol-Chloroform Extraction – an overview / ScienceDirect Topics. Geraadpleegd op 8 maart 2019, beschikbaar op https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-scienc…- extraction

Moretti T.R. et al., (2001, mei). Validation of STR typing by capillary electrophoresis. - PubMed - NCBI. Geraadpleegd op 9 maart 2019, beschikbaar op https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11373005

Séré M., Kaboré J., Jamonneau V., Gaston Belem A.M., Ayala J.F. & De Meeûs T. (2014, juli). Null allele, allelic dropouts or rare sex detection in clonal organisms: simulations and application to real data sets of pathogenic microbes. Pubmed Central, 7-331. doi: 10.1186/1756-3305-7-331

Ugelvig L.V., Nielsen P.S., Boomsma J.J., Nash D.R. (2011). Reconstructing eight decades of genetic variation in an isolated Danish population of the large blue butterfly Maculinea arion. BMC Evolutionary Biology 11(1):201.

University of Nebraska. (z.d.). BIOSAFETY CABINETS [PDF]. Geraadpleegd op 28 maart 2019, beschikbaar op https://ehs.unl.edu/sop/s-bio-cabinet.PDF

Vanden Broeck A., Maes D., Kelager A., Wynhoff I., Wallis de Vries M.F., Nash D.R., Oostermeijer G., Van Dyck H., Mergeay J. Gene flow and effective population sizes of the Alcon blue butterfly Malculinea alcon in a highly fragmented, anthropogenic landscape; (2017) 2017.

Wyseure, E. (2015-2016). Studie van meiose en toepassing van vaderschapsanalyses in de veredeling naar hogere zaadopbrengst bij tetraploïde rode klaver [PDF]. Geraadpleegd op 2 februari 2019, beschikbaar op https://pure.ilvo.be/portal/files/4399767/Elise_Wyseure_thesis.pdf

Zymo Research. (z.d.). OneStep PCR Inhibitor Removal Kit. Geraadpleegd op 10 maart 2019, beschikbaar op https://www.zymoresearch.com/collections/onestep-pcr-inhibitor-removal- kits/products/onestep-pcr-inhibitor-removal-kit

Zymo Research. (z.d.). Zymo-Spin III Columns. Geraadpleegd op 10 februari 2019, beschikbaar op https://www.zymoresearch.com/products/zymo-spin-iii-columns

Universiteit of Hogeschool
Biomedische laboratoriumtechnologie
Publicatiejaar
2019
Promotor(en)
An Vanden broeck, Leen Verschaeve
Kernwoorden
Share this on: