3D printen van een hoornvlies: vooronderzoek gelatine

3D printen van een hoornvlies

‘Tissue engineering’ (TE) is vandaag de dag een van de meest prikkelende onderzoeksdomeinen in de medische wereld. Bovendien veroorzaken de via deze weg geleverde donorweefsels een ethische discussie, wat van TE een veelbesproken onderwerp maakt bij zowel specialisten als leken. Deze studie onderzoekt de mogelijkheid naar het 3D printen van een hoornvlies. Het hoornvlies is de buitenste laag van het oog en is samen met de pupil en de lens verantwoordelijk voor lichttransmissie naar het netvlies. Indien het hoornvlies beschadigd of geïnfecteerd is, is het vormen van een zuiver beeld op het netvlies, omwille van ongecontroleerde lichtstralen,  uitgesloten. In de hele wereld lijden ongeveer 10 miljoen mensen aan verminderd zicht door schade aan het hoornvlies [1][3]. Aangezien er een groot tekort is aan donorweefsel van goede kwaliteit, is het niet mogelijk de grote vraag naar donorweefsel tegemoet te kunnen komen [1][2][3]. Bovendien komen aandoeningen zoals auto-immuunziekten[1] en hoornvliezen met chemische brandwonden niet in aanmerking voor vervanging met donorweefsel. Hierbij komt kijken dat donorweefsels vaak door het lichaam worden afgestoten, vandaar de nood aan hoornvliessubstituten [1]. Momenteel zijn er reeds geteste hoornvliessubstituten om minimale functie voor het oog te herstellen, maar door gebrek aan integratie van gastheercellen zijn deze niet geschikt voor donorweefsel transplantatie [2]. Bovendien worden deze momenteel allen gevormd d.m.v. een mal, wat het productieproces minder rendabel en flexibel maakt. Het uiteindelijke doel van dit onderzoek is om de 3D geprinte hoornvliessubstituten het zicht te laten herstellen op een vergelijkbare manier als met donor transplantaties.

Figuur 1- Het oog en het hoornvlies

Voor het opbouwen van deze 3D structuur is gekozen voor het gebruik van een Aerosol Jet Printer (AJP). Het gebruik van deze AJP in combinatie met het hoornvlies als toepassing maakt deze masterproef uniek. De grote resolutie van de AJP, waardoor materiaal zorgvuldiger gedeponeerd kan worden, de mogelijkheid van gebruik van inkten met wijd bereik aan viscositeit en de aanpasbare afstand van de printkop tot het substraatoppervlak maakt het printen op een 3D oppervlakte met hydrogels[2] mogelijk. Bovendien kan een hoornvliesgeometrie worden ingeladen via CAD[3]-files, deze zijn meestal afkomstig van medische scans. Dit maakt het eenvoudiger om het printen te verwezenlijken. Een bijkomend voordeel is dat de structuren van deze CAD-files geoptimaliseerd kunnen worden. Een ingescand, beschadigd hoornvlies kan dus ‘hersteld’ en aangepast worden, zodat er uiteindelijk een geschikt hoornvlies kan worden geprint en ingeplant.

Figuur 2- Afbeelding van de Aerosol Jet Printer

Het ideale hoornvliessubstituut is biodegradeerbaar en bevordert de weefselregeneratie na een transplantatie [1]. Bovendien mag het printmateriaal na de opsplitsing naar een aerosol[4] in de atomizer[5] niet beschadigd raken en moet ‘overspray’[6] bij de printbaantjes worden geminimaliseerd. Het drooggewicht van de extracellulaire matrix[7] van het hoornvlies bestaat voor 71% uit collageen, dit maakt van collageen het biochemische hoofdbestanddeel van het hoornvlies [2]. Collageen vormt hierom dus het ideale basismateriaal om uiteindelijk een hoornvlies te printen. Omdat collageen een dure stof is en er vele testen zullen moeten worden uitgevoerd naar de parameters en het gedrag van het materiaal in de AJP, is er gezocht naar een alternatief printmateriaal. Dit is gelatine geworden, een andere, gedenatureerde vorm van dezelfde macromolecule [4]. In dit onderzoek heeft men voedingsgelatine, gelatine type A (specifiek aangepast voor celcultuur) en gelatine type B monsters geprint met de AJP.

Deze studie heeft uitgewezen dat de AJP geschikt is voor het printen van kleine 3D structuren.

Voedingsgelatine en gelatine type A gaven bijkomende problemen zoals schuimvorming. Deze schuimvorming voorkwam een goede vorming van een aerosol en gaf bijgevolg een minder goede substraatdekking. Het aanpassen van de temperatuur kon deze schuimvorming niet verminderen. Een ander, belangrijk probleem was condensatie. Deze vernietigde de printresultaten eens het de printkop en bijgevolg het substraat bereikte. Condensatie kon deels verholpen worden door het toevoegen van een warmtebron. Gezien deze echter niet het volledige toevoerbuisje op temperatuur kon brengen, verschoof de condensatie naar de niet verwarmde delen. Een oplossing hiervoor kan de ‘Freeflex Heated tubing[8]’ zijn of men kan rond het toevoerbuisje een weerstandsdraadje wikkelen en deze met gecontroleerde stroomtoevoer verwarmen. Een meer drastische oplossing qua ontwerp zou zijn om ook het draaggas[9] en ‘sheath[10]’ gas verwarmd toe te voeren en de AJP te ‘downsizen’. Dit laatste zou niet alleen voordelig zijn voor de benodigde hoeveelheid hydrogel, maar ook voor de condensatie indien men het toevoerbuisje naar de printkop zou verkorten.

De hydrogel met 5% gelatine type B bleek de beste resultaten te geven bij de printtesten. Hiervoor is dus een specifiek, circulair printpatroon ontworpen.

Het bleek mogelijk om deze monsters na het printen te steriliseren en een protocol op te stellen voor het crosslinken[11] met Genipin[12], zonder dat deze oplosten. Vervolgens konden ze getest worden op biocompatibiliteit. Voor deze biocompatibiliteitstesten werden cellen van het type ATDC 5 ‘mouse cell lines’ in de gelatine monsters uitgezaaid. Een belangrijke conclusie is dat de geprinte gelatine niet toxisch bleek voor de cellen en dat de ingeplante cellen hierin konden prolifereren en zelf collageen startten aan te maken, wat wijst op het hernemen van normale celactiviteit. Hieruit blijkt dat het printen van biologisch materiaal d.m.v. de AJP een beloftevolle techniek is om weefsels te printen, meer bepaald met oog op het leveren van hoornvlies substituten met hoge resolutie.

Referenties

[1] Chao Deng, Fengfu Li, Joanne M. Hackett, Shazia H. ChaudhryBaldwin Toye, William Hodge, May Griffith, Floyd N. Toll, 2008, Collagen and glycopolymer based hydrogel for potential corneal application

[2] Wenguang Liu, Chao Deng, Christopher R. McLaughlin, Per Fagerholm, Belinda Heyne, Juan C. Scaiano, Mitchell A. Watsky, Yasuhiro Kato, Neil S. Lagali, Rejean Munger, Naoshi Shinozaki, Fengfu Li, May Griffith, 2008, Collagen–phosphorylcholine interpenetrating network hydrogels as corneal substitutes

[3] Yang Liu, Li Ren, Yingjun Wang, 2012, Crosslinked collagen–gelatin–Hyaluronic Acid biomimetic film for cornea tissue engineering applications

[4] M.C. Gómez-Guillén, B. Giménez, M.E. López-Caballero, M.P. Montero, 2011, Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources: A review

Figurenlijst

Figuur 1: Opbouw van het hoornvlies: http://www.google.be/imgres?q=cornea&um=1&hl=nl&sa=N&tbo=d&biw=1366&bih=591&tbm=isch&tbnid=thzwUXkIlHSqMM:&imgrefurl=http://www.laramyk.com/resources/education/occular-anatomy/major-ocular-structures/&docid=55B8HASTJ8m51M&imgurl=http://static.laramyk.com/wp-content/uploads/2010/05/cornea_magnified.jpg&w=500&h=352&ei=uDXHUPXjNs2q0AXnkICACw&zoom=1&iact=hc&vpx=4&vpy=206&dur=2873&hovh=188&hovw=268&tx=111&ty=98&sig=110064335841504881477&page=1&tbnh=146&tbnw=222&start=0&ndsp=22&ved=1t:429,r:15,s:0,i:128 Verworven op 11/12/2012

[1] Aandoening, waarbij het lichaam antistoffen maakt tegen lichaamseigen eiwitten

[2] Water absorberende gel van natuurlijke of synthetische polymeren

[3] Computer Aided Design

[4] Verneveling van het printmateriaal d.m.v. een gasstroom

[5] Reservoir in AJP waarin aerosol gevormd wordt

[6] Ongecontroleerde depositie van printmateriaal rond het printbaantje, zorgt voor afname van resolutie

[7] Door weefsels en organen uitgescheiden bij ontwikkeling en voorziet een template waarmee organogenese en wondheling wordt geregeld [2]

[8] Op maat gemaakt verwarmingselement/omhulsel voor kanaalstructuren en buizen

[9] Gas dat de kleine druppeltjes van de aerosol naar de printkop voert

[10] Toegevoegd in printkop om beschadiging van het biologisch materiaal, door botsen met de wand, te vermijden

[11] Maken van bindingen tussen polymeerketens, maakt structuur sterker en stabieler

[12] Chemische crosslinker van plantaardige oorsprong