ENU mutagenesis as a discovery and validation tool of potential driver genes in pancreatic tumourigenesis.

Ontdekking nieuw gen geeft hoop in ontrafeling pancreaskanker.

Wat hebben Luciano Pavarotti, Steve Jobbs, Patrick Swayze en Joan Crawford met elkaar gemeen op hun bekendheid na? Ze stierven allen aan pancreaskanker. Hoewel pancreaskanker niet behoort tot de top 10 van de meest voorkomende kankergevallen in België, is het de 4de hoogste kanker-gerelateerde doodsoorzaak in de wereld. Kersvers VUB-alumnus Mathias Van Bulck legde zijn master thesis jaar af aan het gerenommeerde Australische ‘Garvan Institute of Medical Research’ waar hij onder leiding van Prof. Dr. Ilse Rooman en haar team onderzoek deed naar de ontwikkeling en progressie van deze ziekte d.m.v. muismodellen. Een hogere expressie van het nieuwe gen GUCD1 zou een rol spelen in het ontstaan van de omstandigheden die de aanzet voor pancreaskanker vormen.

De pancreas, een vitaal orgaan.

De pancreas bestaat uit een exocrien deel, verantwoordelijk voor de productie en het transport van spijsverteringsenzymen en een endocrien deel, dat instaat voor het op peil houden van de bloedsuiker. Het exocrien deel bevat verschillende functionele eenheden die op hun beurt uit cellen bestaan die een bepaalde taak hebben. Duct cellen zijn gegroepeerd in kanalen (ducti) die zorgen voor het transport van enzymen geproduceerd door acinaire cellen.

Pancreaskanker, niet zo onbenullig.

Ductaal pancreas adenocarcinoom (PDAC) is de meest voorkomende vorm van pancreaskanker. Bij diagnose hebben patiënten een gemiddelde levensverwachting van 6 maanden. Wat niet onverklaarbaar is. Wetende dat patiënten met pancreaskanker vijf jaar na diagnose een overlevingskans van slechts vijf procent hebben. Het voorkomen van de ziekte vóór de leeftijd van 40 jaar is zeldzaam aangezien de gemiddelde leeftijd van diagnose 70 jaar is. Gekende risicofactoren zijn roken, overgewicht, chronische inflammatie van de pancreas, familiegeschiedenis en een diabetis verleden. “Een vroege opsporing en betere behandeling is daarom broodnodig om de levensverwachting te verbeteren” aldus promotor en hoofd van de ‘Pancreatic tumourigenesis group’ Prof. Dr. I. Rooman. Dit kan enkel door het verkrijgen van fundamentele inzichten in het ontstaan van de kanker en hoe men deze zo vroeg mogelijk kan opsporen.

Muizen brengen verduidelijking.

Recente analyses in muismodellen van PDAC toonden aan dat duct-achtige tumoren kunnen ontstaan uit acinaire cellen via een mechanisme van acinaire-ductale metaplasie (ADM). ADM houdt in dat acinaire cellen worden omgezet naar cellen met duct-achtige eigenschappen. Het ontdekken van genen die verantwoordelijk zijn voor deze omzetting oftewel de aanzet van een tumor gevoelige omgeving kan informatief zijn voor nieuwe detectie- en behandelingsstrategieën.

Om deze genen te ontdekken en valideren gebruikten we een techniek, genaamd N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) mutagenese, die willekeurige mutaties aanbrengt in het genoom van muizen. Deze muizen dienden als basis voor het ontdekken en valideren van genen die potentieel betrokken zijn in ADM en de ontwikkeling van PDAC. We integreerden deze data met resultaten van DNA-sequentie en proteine analyse in tumorstalen van patiënten.

In de ontdekkingsstrategie ondergingen muizen een ‘forward’ ENU mutagenese, waarna het nageslacht van deze muizen werd onderzocht op ADM en verhoogde celdeling in de pancreas. Vervolgens werd next generation sequencing (NGS), een techniek die DNA sequenties op grote schaal vermenigvuldigt, van de muizen met een abnormaal uitziende pancreas gebruikt om de gemuteerde genen op te sporen.

Verder onderzoek van de aangetaste muizenstamboom correleerde de muizen met een abnormaal uitziende pancreas, met één bepaalde mutatie in het ongekarakteriseerde gen GUCD1. Mutaties in dit gen bevonden zich in een zeer geconserveerd functionele regio van het gen en werden 'waarschijnlijk schadelijk' bevonden door computer gebaseerde voorspellingsmethoden.

Onderzoek op pancreascellen afkomstig van GUCD1 mutante muizen geanalyseerd in een specifieke in vitro ADM test vertoonden hogere expressie van GUCD1 en transcriptiefactor Sox9, een ductaal gen dat sterk gekoppeld is aan ADM en PDAC ontwikkeling alsook een verlaging van een acinaire transcriptiefactor (Ptf1a), nodig voor de ontwikkeling van het exocriene deel van de pancreas en het verteringsenzyme amylase. GUCD1 expressie uit stalen van patiënten met pancreaskanker bleek omgekeerd evenredig te zijn met de respectievelijke overleving van deze patiënten. Analyse van het GUCD1 mRNA, de sequentie die omgezet wordt tot aminozuursequentie en aldus eiwitten, vertoonde echter een significante daling van pancreas tumorvorming in muismodellen. Overexpressie van GUCD1 (waarbij het gen op een kunstmatige manier tot hoge expressie komt) in de muis acinaire cellijn resulteerde niet in een verandering van het acinaire uitzicht van deze cellen.

In het validatieluik van deze thesis gebruikten we muizen met een reeds gekende ENU-geïnduceerde mutatie in het circadiaanse (slaap-waakritme) gen TIMELESS (TIM). Eerdere data toonden aan dat genetische afwijkingen in het TIM gen aanwezig zijn in ongeveer 10% van PDAC stalen van patiënten. Pancreascellen van mutante TIM muizen werden onderworpen aan de specifieke in-vitro ADM assay maar vertoonden geen verschillen in ADM-gerelateerde genexpressie, op een verhoging van Sox9 na. Deze voorlopige resultaten suggereren dat Tim niet uitgesproken betrokken is in ADM, wat een rol in de reeds gevormde tumor echter niet uitsluit.

Wat hebben we nu geleerd?

Het gebruik van mutagenese technieken in de studie van pancreaskanker kan zowel in een ontdekkings- als validatiestrategie tot nieuwe inzichten resulteren. Het Australische instituut wil met zijn nieuwste initiatief: ‘The Kinghorn Cancer Centre’ een voortrekker zijn in de ontwikkeling van ‘de therapie op maat’. Volgens M. Van Bulck kunnen de inzichten uit dit werk verder onderzoek sturen waardoor de gepersonaliseerde geneeskunde met een therapie op maat van de patiënt een stap dichterbij komt. Zowel onze aanpak met het oog op nieuwe ontdekkingen als deze voor validatie  vereisen verdere functionele studies om de rol van GUCD1 en TIM in respectievelijk ADM en pancreaskanker ontwikkeling te definiëren.