LINE-1 als humaan pathogeen

Het menselijke DNA is niet statisch, maar kan continu veranderen door de opeenstapeling van stukjes mobiel DNA. Binnen dit mobiel DNA zijn er verschillende klasses, waarvan retrotransposons de belangrijkste groep vormt. Deze zijn in staat om zichzelf te vermenigvuldigen via een kopieer‑en‑plak mechanisme. Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1) is het enige retrotransposon dat nog in staat is zichzelf te vermenigvuldigen. Ongecontroleerde LINE-1 retrotranspositie kan worden geassocieerd met heel wat neurologische aandoeningen, zoals Rett syndroom en Ataxia Telangiectasa. Echter, op dit moment is de specifieke rol van LINE-1 nog niet volledig gekend. Er is nood aan verder onderzoek naar de rol van gastheerfactoren en het proces van LINE-1 retrotranspositie. In mijn scriptie heb ik de rol van transportine-1 (TNPO1) en transportine-3 (TNPO3) in LINE-1 retrotranspositie onderzocht. In een tweede deel werd een assay geoptimaliseerd in een neuronale cellijn en in een laatste deel werden hersenen van muizen aangekleurd voor een proteïne van LINE-1.

1. Het proces van LINE-1 retrotranspositie

Ongeveer 17% van ons DNA bestaat uit LINE-1 kopieën, waarvan de meerderheid echter geen retrotranspositie meer kan ondergaan. Er zijn slechts 80 à 100 actieve kopieën aanwezig in ons DNA die kunnen bijdragen tot variatie. Een LINE-1 element, aanwezig in het menselijke DNA in de celkern, kan worden afgeschreven naar boodschapper RNA. Vervolgens wordt dit RNA naar het cytosol overgebracht, waar de info in het RNA wordt vertaald naar proteïnen. Dit proces resulteert in de expressie van 2 proteïnen, namelijk het ORF1 proteïne (ORF1p) en het ORF2 proteïne (ORF2p). Vervolgens wordt een complex gevormd bestaande uit het boodschapper RNA, het ORF1p en het ORF2p. Dit complex wordt terug naar de celkern gebracht en een nieuwe kopie van LINE-1 kan zich integreren in het DNA. Op deze manier is een nieuwe kopie van LINE-1 aanwezig in het menselijke DNA dat ook zichzelf kan kopiëren (Figuur 1).

                                                                             Figuur 1: Het proces van LINE-1 retrotranspositie

2. De LINE-1 retrotranspositie test

De LINE-1 retrotranspositie test laat toe om de rol van gastheerfactoren te onderzoeken in het proces van LINE-1 retrotranspositie. In deze test worden cellen getransfecteerd met een plasmide dat het LINE-1 element bevat (L1RP) gekoppeld aan een reporter, namelijk het EGFP proteïne. Nadat dit plasmide in de cellen is opgenomen, kan LINE-1 retrotranspositie plaatsvinden in de cel. Het EGFP proteïne laat toe om de retrotranspositie te visualiseren. Er zal enkel expressie zijn van het EGFP proteïne als er ook LINE-1 retrotranspositie optreedt in de cel. Als een controle in deze test, worden de cellen getransfecteerd met een LINE-1 plasmide die geen retrotranspositie meer kan ondergaan door mutatie (JM111).

3. Identificatie van TNPO1 en TNPO3 als gastheerfactor van LINE-1

Net zoals het HIV virus, heeft LINE-1 ook gastheerfactoren nodig in de gastcel om zich te kunnen vermenigvuldigen. In een eerste deel van mijn scriptie werd de rol van TNPO1 en TNPO3 onderzocht voor hun mogelijke rol in de import van het LINE-1 complex in de nucleus. Aan de hand van de LINE-1 retrotranspositie test werd nagegaan of beide een rol spelen in LINE-1 retrotranspositie. Er werden cellen gecreeërd waarin de expressie van het TNPO1 of het TNPO3 proteïne werd onderdrukt. Op deze manier werd een TNPO1 knockdown (KD) en TNPO3 KD cellijn gecreeërd. Deze cellijnen werden nadien getest in de LINE-1 retrotranspositie test en de expressie van het EGFP proteïne werd gevolgd voor alle condities. Er was een duidelijke daling in de expressie van het EGFP proteïne voor zowel de cellijn met minder TNPO1 als de cellijn met minder TNPO3 (Figuur 2). Deze resultaten lijken de hypothese te bevestigen, maar verder onderzoek is nodig naar hun specifieke rol in het proces.

                                                                                  Figuur 2: Daling in EGFP expressie in TNPO1 en TNPO3 KD cellijnen

4. Optimalisatie van LINE-1 retrotranspositie test in een neuronale cellijn

In het verleden werd reeds aangetoond dat LINE-1 retrotranspositie kan optreden in de hersenen en kan bijdragen aan de ontwikkeling van neurologische aandoeningen. Omdat gastheerfactoren specifiek kunnen zijn voor bepaalde cellijnen, is het relevant om ook de LINE-1 retrotranspositie test te kunnen uitvoeren in een neuronale cellijn. In een tweede deel van mijn scriptie heb ik geprobeerd om de test te optimaliseren in SH-SY5Y cellen. Om de test succesvol te kunnen uitvoeren is het belangrijk dat de cellen het plasmide opnemen in hun cytosol/celkern. Er werden verschillende methodes gebruikt om dit te optimaliseren, maar geen enkele geteste methode was in staat om het plasmide binnen te brengen in deze SH-SY5Y cellen. Verder onderzoek dient uit te wijzen of er andere methoden bestaan die wel in staat zijn om het LINE-1 plasmide in de cel te brengen. Eens dit is bereikt, kan de test worden uitgevoerd in deze cellijn. Op deze manier kunnen ook gastheerfactoren specifiek voor een bepaald celtype geïdentificeerd worden.

5. Optimalisatie van kleuring voor het ORF1p

Met het oog op verder onderzoek naar de potentiële rol van LINE-1 retrotranspositie in neurologische aandoeningen, voornamelijk de pathogenese van de ziekte van Parkinson, is detectie van het ORF1p in de hersenen van de muis nodig. In een laatste deel van mijn scriptie heb ik zowel de immunohistochemische als de immunofluorescente kleuring voor het ORF1p geoptimaliseerd op hersencoupes van wild-type muizen. Bovendien laat de optimalisatie van de immunofluorescente kleuring toe om een dubbele kleuring uit te voeren. Wanneer een dubbele kleuring werd uitgevoerd voor tyrosine hydroxylase (TH), kenmerkend voor dopaminerge neuronen, en het ORF1p bleek een hoge expressie van het ORF1p in de TH positieve cellen in de substantia nigra (Figuur 3). De optimalisatie van de 2 verschillende kleuringen in wild-type muizen laat toe om andere muismodellen te screenen voor hun expressie van het ORF1p.

                                                                               Figuur 3: Expressie van TH en ORF1p in substantia nigra

6. Conclusie

Met mijn scriptie heb ik bijgedragen aan het basisonderzoek naar LINE-1 retrotranspositie. Er is echter een nood aan verder onderzoek naar de betrekking van gastheerfactoren. Ook dient de rol van LINE-1 in de ontwikkeling van neurologische aandoeningen verder onderzocht te worden. Directe onderdrukking van LINE-1 of indirecte onderdrukking via inhibitie van gastheerfactoren, kan mogelijks leiden tot potentiële behandelingsstrategieën van neurologische aandoeningen.