Confocale microscopietechnieken in het onderzoek naar het werkingsmechanisme van een nieuw en uniek anti-HIV middel

Karlijn Valkenborgh
Alvorens HIV de gastheercel binnendringt, bindt het virale gp120 aan de CD4-receptor van de gastheercel. Eenmaal het HIV gebonden is ondergaat het gp120 een conformatieverandering wat uiteindelijk leidt tot het versmelten van de membranen van de gastheercel en het virus. Het CADA-product is in staat de CD4-receptor te downmoduleren. Dit zorgt ervoor dat er geen binding meer zal zijn tussen het gp120 van HIV en de CD4-receptor van de gastheercel.

Confocale microscopietechnieken in het onderzoek naar het werkingsmechanisme van een nieuw en uniek anti-HIV middel

Alvorens HIV de gastheercel binnendringt, bindt het virale gp120 aan de CD4-receptor van de gastheercel. Eenmaal het HIV gebonden is ondergaat het gp120 een conformatieverandering wat uiteindelijk leidt tot het versmelten van de membranen van de gastheercel en het virus. Het CADA-product is in staat de CD4-receptor te downmoduleren. Dit zorgt ervoor dat er geen binding meer zal zijn tussen het gp120 van HIV en de CD4-receptor van de gastheercel. HIV kan niet meer binnendringen in de gastheercellen, niet meer repliceren en dus ook geen nieuwe virions meer vormen.

 

Met behulp van flowcytometrie en verschillende monoclonale antilichamen werd het werkingsmechanisme van het antivirale CADA-product in detail onderzocht. Nadat Hela CD4+ cellen en MT4 (CD4+) cellen behandeld werden met CADA werd er een duidelijke CD4-downmodulatie vastgesteld. De procentuele CD4-downmodulatie was voor beide cellijnen identiek. De CD4-downmodulatie is dus onafhankelijk van het type cellijn. Door gebruikt te maken van de competitie tussen verschillende mAb voor bindingsplaatsen op de CD4-receptor, is gebleken dat het CADA-product niet bindt op het extracellulaire gedeelte van de de CD4-receptor. Na behandeling van de Hela CD4+ cellen met CADA en incubatie met verschillende mAb, die elk binden op een andere bindingsplaats op de CD4-receptor, werd een identieke procentuele verlaging van het emissiesignaal vastgesteld. De behandeling van CD4+ cellen met CADA resulteert in een downmodulatie van de volledige CD4-receptor.

 

Om het werkingsmechanisme van het CADA-product beter te begrijpen, werd er gewerkt met een fluorescente analoog nl. KKD-016. Uit voorafgaand onderzoek is gebleken dat KKD-016 dezelfde antivirale en biologische eigenschappen heeft als CADA. Met behulp van confocale microscopie kunnen we het KKD-016 zien in de cellen omwille van zijn fluorescente eigenschap. Het product wordt in de cellen opgenomen afhankelijk van de aanwezige concentratie van het product in het cultuurmedium. Deze dosisafhankelijke opname toont flowcytometrisch een dosisafhankelijke effect op de CD4-downmodulatie. Zelfs na 2 uur incubatie van de Hela CD4+ cellen met KKD-016 is er een duidelijke opname van het product. Verder werd met behulp van kern- en membraankleuringen vastgesteld dat het product (KKD-016) niet doordringt tot in de kern van de cellen maar zich lokaliseert in het cytoplasma.

 

Door Hela cellen te transfecteren met CD4-YFP brengen deze cellen een fluorescente CD4-receptor tot expressie. Met het oog op het bekomen van een sterk CD4+ cellijn werden de CD4+-getransfecteerde cellen geïsoleerd uit het celmengsel en verder opgekweekt.

Wanneer deze cellen na het opkweken in dezelfde mate de fluorescente CD4-receptor tot expressie brengen, kunnen ze worden behandeld met CADA of KKD-016 om de CD4-downmodulatie verder te onderzoeken.

Bibliografie

 

[1]       SHI Y, ALBERT J, FRANCIS G, HOLMES H, FENYO EM: A new cell line-based neutralization assay for primary HIV type 1 isolates. AIDS Res. Hum. Retrovir. (2002) 18 : 957-967.

[2]       WYATT  R, SODROSKI J: The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science (1998) 280: 5371, 1884-8. Review.

[3]       WENG Y, YANG Z, WEISS CD: Structure-function studies of the self-assembly domain of the human immunodeficiency virus type 1 transmembrane protein gp41.  Virology (2000) 11: 5368-72. Erratum in: Virology 20: 9811           

[4]       CHAN C, KIM SK: Minireview. HIV entry and its inhibition. Cell.(1998) 93: 681-684.

[5]       HERNANDEZ LD, HOFFMAN LR, WOLFSBER TG, WHITE JM: Virus-cell and cell-cell fusions. Annu. Rev. Dev. Cell Biol. (1996) 12: 627-661

[6]       FERGUSON MR, ROJO DR, VON LINDERN J, O'BRIEN WA: HIV-1 replication cycle. Clin. Lab. Med. (2002) 611-35.

[7]       LITTMAN DR: The structure of the CD4 and CD8 genes. Ann. Rev. Immunol. (1987) 5:561-584.

[8]       LEAHY DJ: A structural view of CD4 and CD8. FASEB J. (1995) 9:17-25.

[9]       WANG JH, YAN YW, GARRETT TP et al.: Atomic structure of a fragement of human CD4 containing two immunoglobulin-like domains. Nature (1990) 348: 411-418.

[10]     RYU SE, KWONG PD, TRUNEH A et al.: Crystal structure of an HIV-binding recombinant fragment of human CD4. Nature (1990) 348: 419-426.

[11]     RICHARDSON NE, BROWN NR, HUSSEY RE et al.: Binding site for human immunodeficiency virus coat protein gp120 is located in the NH2-terminal region of T4 (CD4) and requires the intact variable-region-like domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:6102-6106.

[12]     KRUISBEEK AM, MOND JJ, FOWLKES BJ, CARMEN JA, BRIDGES S, LONGO DL: Absence of the Lyt-2-,  L3T4+ lineage of T-cells in mice treated neonatally with anti-I-A correlates with absence of intrathymic I-A-bearing antigen-presenting cell function. J.Exp.Med. (1985) 161: 1029-1047.

[13]     LAMARRE D, CAPON DJ, KARP DR, GREGORY T, LONG EO, SEKALY RP: Class ІІ MHC molecules and the HIV gp 120 envelope protein interact with functionally distinct regions of the CD4 molecule. EMBO J. (1989) 8: 3271-3277.

[14]                 RUDD CE, TREVILLYAN JM, DASGUPTA JD, WONG LL, SCHLOSSMAN SF: The CD4 receptor is complexed in detergent lysates to a protein-tyrosine kinase (pp58) from human T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 5190-5194.

[15]     ARTHOS J, DEEN KC, CHAIKIN MA et al.: Identification of the residues in human CD4 critical for the binding of HIV. Cell (1989) 57: 469-481.

[16]     CLAYTON LK, SIEN M, PIOUS DA, REINHERZ EL: Identification of human CD4 residues affecting class ІІ MHC versus HIV-1 gp120 binding. Nature (1989) 339:548-551.

[17]     MIZUKAMI T, FUERST TR, BERGER EA, MOSS B: Binding region for human immunodeficiency virus (HIV) and epitopes for HIV-blocking monoclonal antibodies of the CD4 molecule defined by site-directed mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 9273-9277.

[18]     MOEBIUS U, CLAYTON LK, ABRAHAM S, HARRISON SC, REINHERZ EL: The human immunodeficiency virus gp120 binding site on CD4: delineation by quantitative equilibrium and kinetic binding studies of mutants in conjunction with a high-resolution CD4 atomic structure. J. Exp. Med. (1992) 176: 507-517.

[19]     VERMEIRE K, ZHANG Y, PRINCEN K, HATSE S, SAMALA M, DEY K, CHOI H, SODOMA A, SNOECK R, ANDREI G, DE CLERQ E, BELL T, SCHOLS D: CADA Inhitbits Human Immunodeficiency Virus and Human Herpesvirus 7 Replication by Down-modulation of the Cellular CD4-receptor. Virology (2002). 302: 342-353.

[20]     VERMEIRE K, PRINCEN K, HATSE S et al.: A novel CD4-targeted HIV inhibitor, is synergistic with various anti-HIV drugs in vitro. AIDS (2004) 18: 2115-2125.

[21]     VERMEIRE K, BELL T, CHOI H, JIN Q, SAMALA M, SODOMA A, DE CLERCQ E, SCHOLS D: The anti-HIV potency of cyclotriazadisulfonamide analogs is directly correlated with their ability to down-modulate the CD4 Receptor. Mol. Pharm. (2003) 63: 203-210.

[22]     VERMEIRE K, LISCO A, GRIVEL J, SCARBROUGH E, DEY K, DUFFY N, MARGOLIS L, BELL T, SCHOLS D: Desing and Cellular Kinetics of Dansyl-labeled CADA Derivatives with Anti-HIV and CD4 Receptor Down-Modulating Activity. (2007) Biochem. Pharmacol., in press.

[23]     VERMEIRE K, SCHOLS D: Specific CD4 down-modulating compounds with potent anti-HIV activity. J. Leukoc Biol (2003) 74: 667-675.

Universiteit of Hogeschool
Biomedische laboratorium technologie
Publicatiejaar
2007
Kernwoorden
Share this on: