ANABOLIC RESPONSE TO ORAL LEUCINE ADMINISTRATION IS IMPAIRED IN SKELETAL MUSCLE OF PHD1 KO MICE

Marie Roosendaal
Kan leucine de gekende negatieve gevolgen van aandoeningen zoals bloedarmoede en chronisch longlijden op spiermassa verminderen?Iedereen weet hoe het voelt als je een inspanning doet op hoogte. Skiën, fietsen, wandelen of lopen voelt veel uitputtender aan op 3000m hoogte dan bij ons in België op zeeniveau. De hoogte zorgt er immers voor dat je minder zuurstof kan inademen.Patiënten die lijden aan bepaalde bloed- of longziekten kampen met zo’n chronisch tekort aan zuurstof, ook ‘hypoxie’ genoemd. Één van de belangrijkste symptomen van zulke ziektes is een zeer sterk verlies aan spiermassa.

ANABOLIC RESPONSE TO ORAL LEUCINE ADMINISTRATION IS IMPAIRED IN SKELETAL MUSCLE OF PHD1 KO MICE

Kan leucine de gekende negatieve gevolgen van aandoeningen zoals bloedarmoede en chronisch longlijden op spiermassa verminderen?

Iedereen weet hoe het voelt als je een inspanning doet op hoogte. Skiën, fietsen, wandelen of lopen voelt veel uitputtender aan op 3000m hoogte dan bij ons in België op zeeniveau. De hoogte zorgt er immers voor dat je minder zuurstof kan inademen.

Patiënten die lijden aan bepaalde bloed- of longziekten kampen met zo’n chronisch tekort aan zuurstof, ook ‘hypoxie’ genoemd. Één van de belangrijkste symptomen van zulke ziektes is een zeer sterk verlies aan spiermassa. Dit gebeurt omdat langdurige zuurstofnood de aanmaak en afbraak van eiwitten, de bouwstenen van spieren, negatief beïnvloedt. Deze spieratrofie, of het verminderen van de doorsnede en dus massa van spiercellen, kan leiden tot krachtverlies, wat allerlei negatieve gevolgen met zich mee brengt, zoals een daling van levenskwaliteit en vergroot gevaar op vallen en blessures. Reeds geruime tijd is de mens naar middelen op zoek om dit verlies aan kracht tegen te gaan. Zo zijn bepaalde stimuli zoals krachttraining en eiwitinname mogelijkheden om spieratrofie tegen te gaan. Interessant genoeg blijkt het essentiële (het lichaam kan het zelf niet aanmaken) aminozuur ‘leucine’ een belangrijke en specifieke functie te hebben in de synthese van nieuwe eiwitten.

Nieuwe eiwitten worden gevormd via overschrijving (transcriptie) van DNA tot mRNA. En mRNA wordt op zijn beurt via een proces dat vertaling (translatie) wordt genoemd, omgebouwd tot proteïnen. Het is deze translatie die beïnvloedt wordt door leucine en andere externe stimuli zoals voedingsmiddelen, hypoxie, ...

mTOR (mammalian target of rapamycin) is een sleutelmolecule in dit proces. Het combineert alle externe signalen om de aanmaak en afbraak van eiwitten te controleren. Hormonen zoals insuline activeren een cascade van enzymes die mTOR activeren, waardoor mTOR andere doelen kan activeren. Dit leidt uiteindelijk tot activatie van proteïnesynthese.

Aan de ene kant hebben we dus de nefaste effecten van chronische hypoxie en aan de andere kant de positieve invloed van leucine op het eiwitmetabolisme en spieraanmaak.  De vraag die vooropgesteld wordt in dit onderzoek luidt als volgt:

Kan leucine, dat dagelijks via de voeding wordt ingenomen, de gekende negatieve gevolgen van aandoeningen zoals bloedarmoede en chronisch longlijden op spiermassa verminderen en/of verhelpen?

Om ethische en logistieke redenen en omwille van problemen van standaardisatie is het zeer moeilijk  onderzoek te doen bij mensen die gedurende een lange tijd op hoogte verblijven. Daarom hebben we dit onderzoek verricht op genetisch gemodificeerde muizen die het gen PHD1 (prolyl-hydroxylase 1) niet hadden. Prolyl-hydroxylase 1 zijn enzymen die ‘voelen’ wanneer er genoeg zuurstof voorhanden is in de cel. Wanneer deze enzymen ontbreken, zoals bv. bij deze muizen, gaat een ander molecule hypoxia-inducible-factor of HIF sterk tot expressie komen, omdat het niet meer kan afgebroken worden. Kort gezegd, we hebben onze muizen zo genetisch veranderd dat ze als het ware ‘chronisch’ op ‘hoogte’ leven. Ook al leven ze gewoon bij ons op het sportkot in Leuven, op zeeniveau.

Om onze vooropgestelde hypothese te testen - gaat het gemodificeerde type muizen nu minder goed reageren op de toediening van leucine?- hebben we 4 groepen gemaakt. Ze staan opgelijst in onderstaande tabel:

 

Tabel 1: groepen die gecreëerd warden voor de studie

Groep

Type muis

Toediening van?

Aantal?

Naam

1

Wild type, geen modificatie

Water

5

WT/CTRL

2

Wild type, geen modificatie

Leucine

6

WT/LEU

3

PHD genetisch gemodificieerd

Water

7

KO/CTRL

4

PHD genetisch gemodificieerd

Leucine

7

KO/LEU

 

 

Op de dag van het experiment werden de muizen nuchter (ze hadden al 8 uur niet gegeten) naar het labo spierfysiologie op het sportkot gebracht. Achtereenvolgens werd dan water of leucine ingebracht bij elke muis van elke groep. Er werd 30 minuten gewacht zodat de stof kon worden opgenomen in het bloed. Hierna werden de muizen in slaap gebracht en werden de verschillende spieren en organen eruit genomen. Deze werden meteen in vloeibare stikstof gedaan om alle fysiologische processen stil te leggen. Deze stalen werden dan opgeslagen in een zeer koude diepvries (-80°C).

Een maand later werden deze stalen geanalyseerd in het labo via de techniek western blot, dit is een van de meest gebruikte technieken in de biochemie. Kort gezegd worden er met behulp van antilichamen specifieke moleculen (ook eiwitten) onderzocht. Hieruit kan men dan afleiden of er meer of minder eiwitsynthese of -afbraak is.

Hoe zagen de resultaten eruit? Bij het analyseren van de stalen bekomen we een figuur die er typisch uitziet zoals Figuur 1 (zie bijlage). In de X-as staan de verschillende groepen (zie tabel 1), in de y-as staat de ‘activatie’ van een specifiek eiwit dat te maken heeft met eiwitaanmaak en dus spiergroei. 

Er vallen 2 zaken op.

  • Leucine zorgt voor een activatie van eiwitsynthese in gezonde normale wild type muizen.
  • In de genetisch gemodificeerde muizen is er al een sterke activatie in nuchtere toestand. Deze activatie wordt teniet gedaan door toediening van leucine.

Wat kunnen we hieruit afleiden? Het is duidelijk dat de modificatie van de muizen, die zorgt voor een ‘constante hypoxische stimulus’ iets teweeg brengt in hun spiercellen. Ze  creëren een soort overgevoeligheid in nuchtere toestand en toediening van leucine doet deze overgevoeligheid teniet.

Dit onderzoek is slechts het prille begin van de ontrafeling van moleculaire pathways die te maken hebben met eiwitsynthese en zuurstofnood. Verdere studies zijn nodig om die ‘overgevoeligheid’ te bepalen bij de gemodificeerde  muizen. Deze studie bevestigt het cliché ‘hoe meer je weet, hoe meer je beseft dat je niet weet’, maar dat maakt wetenschappelijk onderzoek juist zo interessant.

Bibliografie

Reference List

1. Ambrosini G, Nath AK, Sierra-Honigmann MR, Flores-Riveros J. Transcriptional activation of the human leptin gene in response to hypoxia. Involvement of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 277(37):34601–9, 2002.

2. André C, Cota D. Coupling nutrient sensing to metabolic homoeostasis: the role of the mammalian target of rapamycin complex 1 pathway. P Nutr Soc 71(4):502–10, 2012.

3. Aragonés J, Schneider M, Van Geyte K, Fraisl P, Dresselaers T, Mazzone M, Dirkx R, et al. Deficiency or inhibition of oxygen sensor Phd1 induces hypoxia tolerance by reprogramming basal metabolism. Nat Genet 40(2):170–80, 2008.

4. Avruch J, Hara K, Lin Y, Liu M, Long X, Ortiz-Vega S, Yonezawa, K. Insulin and amino-acid regulation of mTOR signaling and kinase activity through the Rheb GTPase. Oncogene 25(48) :6361–72, 2006.

5. Baillie AG, Garlick PJ, Garlick J. Responses of protein synthesis in different skeletal muscles to fasting and insulin in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab 260:E891-E896, 1991.

6. Baldi S, Aquilani R, Pinna GD, Poggi P, De Martini A, Bruschi C. Fat-free mass change after nutritional rehabilitation in weight losing COPD: role of insulin, C-reactive protein and tissue hypoxia. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 5:29–39, 2010.

7. Barazzoni R, Short KR, Asmann Y, Coenen-Schimke JM, Robinson MM, Nair KS. Insulin fails to enhance mTOR phosphorylation, mitochondrial protein synthesis and ATP production in human skeletal muscle without amino acid replacement. Am J Physiol-Endoc M, 2012.

8. Bhagwat SV, Crew AP. Novel inhibitors of mTORC1 and mTORC2. Curr Opin Investig Drugs 11:638-645, 2010.

9. Bianchi G, Marzocchi R, Agostini F, Marchesini G. Update on nutritional supplementation with branched-chain amino acids. Curr Opin Clin Nutr 8(1):83–7, 2005.

10. Bolster DR, Vary TC, Kimball SR, Jefferson LS. Biochemical and Molecular Actions of Nutrients Leucine Regulates Translation Initiation in Rat Skeletal Muscle Via Enhanced eIF4G Phosphorylation. J Nutr (4):1704–1710, 2004.

11. Brown EJ, Beal PA, Keith CT, Chen J, Bum Shin T, Schreiber SL. Control of p70 S6 kinase by kinase activity of FRAP in vivo. Nature 377:441 – 446, 1995.

12. Cafferkey R, Young PR, Mclaughlin MM, Bergsma DJ, Koltin Y, Sathe GM, Faucetie LEO, et al. Protein related to mammalian dominant missense mutations in a novel yeast protein related to mammalian phosphatidylinositol 3-Kinase and VPS34 abrogate rapamycin cytotoxicity. Mol Cell biol 13(10):6012, 1993.

 

13. Cota D, Proulx K, Smith KaB, Kozma SC, Thomas G, Woods SC, Seeley RJ. Hypothalamic mTOR signaling regulates food intake. Science (New York, N.Y.) 312(5775):927–30, 2006.

14. Deldicque L, Sanchez Canedo C, Horman S, De Potter I, Bertrand L, Hue L, Francaux M. Antagonistic effects of leucine and glutamine on the mTOR pathway in myogenic C2C12 cells. Amino Acids 35(1):147–55, 2008.

15. Deldicque L, Theisen D, Francaux M. Regulation of mTOR by amino acids and resistance exercise in skeletal muscle. Eur J Appl Physiol 94:1-10, 2005.

16. Dennis MD, Baum JI, Kimball SR, Jefferson LS. Mechanisms involved in the coordinate regulation of mTORC1 by insulin and amino acids. J Biol Chem 286:8287-8296, 2011.

17. Deyoung MP, Horak P, Sofer A, Sgroi D, Ellisen, LW. Hypoxia regulates TSC1/2-mTOR signaling and tumor suppression through REDD1-mediated 14 – 3 – 3 shuttling. Gene Dev 239–251, 2008.

18. D’Hulst G, Jamart C, Van Thienen R, Hespel P, Francaux M, Deldicque L. Effect of acute environmental hypoxia on protein metabolism in human skeletal muscle. Act Physiol (Oxford, England) 1–14, 2013.

19. Dodd KM, Tee AR. Leucine and mTORC1: a complex relationship. Am J Physiol-Endoc M 302(11):E1329–42, 2012.

20. Donato J, Pedrosa RG, Cruzat VF, Pires ISDO, Tirapegui J. Effects of leucine supplementation on the body composition and protein status of rats submitted to food restriction. Nutrition (Burbank, Los Angeles County, Calif.) 22(5):520–7, 2006.

21. Drummond MJ, Bell JA, Fujita S, Dreyer HC, Glynn EL, Volpi E, Rasmussen BB. Amino acids are necessary for the insulin-induced activation of mTOR/S6K1 signaling and protein synthesis in healthy and insulin resistant human skeletal muscle. Clin Nutr 27:447-456, 2008.

22. Durán RV, Mackenzie ED, Boulahbel H, Frezza C, Heiserich L, Tardito S, Bussolati O, et al. HIF-independent role of prolyl hydroxylases in the cellular response to amino acids. Oncogene (4):1–8, 2012.

23. Efeyan A, Zoncu R, Sabatini DM. Amino acids and mTORC1: from lysosomes to disease. Trends Mol Med 18(9):524–33, 2012.

24. Etheridge T, Atherton PJ, Wilkinson D, Selby A, Rankin D, Webborn N, Smith K, et al. Effects of hypoxia on muscle protein synthesis and anabolic signaling at rest and in response to acute resistance exercise. Am J Physiol-Endoc M 301(4):E697–702, 2011.

25. Favier FB, Costes F, Defour A, Bonnefoy R, Lefai E, Baugé S, Peinnequin A, et al. Downregulation of Akt/mammalian target of rapamycin pathway in skeletal muscle is associated with increased REDD1 expression in response to chronic hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 298(6):R1659–66, 2010.

 

26. Garvey JF, Taylor CT, McNicholas WT. Cardiovascular disease in obstructive sleep apnoea syndrome: the role of intermittent hypoxia and inflammation. Eur Respir J 33(5):1195–205, 2009.

27. Grocott M, Montgomery H, Vercueil A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care (London, England) 11(1):203, 2007.

28. Gulati P, Gaspers LD, Dann SG, Joaquin M, Nobukuni T, Natt F, Kozma SC, et al.

Amino acids activate mTOR complex 1 via Ca2+/CaM signaling to hVps34. Cell Metab 7(5):456–65, 2008.

29. Han D, Wen L, Chen Y. Molecular cloning of phd1 and comparative analysis of phd1, 2, and 3 expression in Xenopus laevis. ScientificWorldJournal 689287, 2012.

30. Hay N, Sonenberg N. Upstream and downstream of mTOR. Genes Dev 18:1926-1945, 2004.

31. Hoppeler H, Kleinert E, Schlegel C, Claassen H, Howald H, Kayar SR, Cerretelli P. Morphological adaptations of human skeletal muscle to chronic hypoxia. Int J Sports Med 11(Suppl 1):S3-S9, 1990.

32. Inoki K, Li Y, Zhu T, Wu J, Guan K-L. TSC2 is phosphorylated and inhibited by Akt and suppresses mTOR signalling. Nat Cell Biol 4(9):648–57, 2002.

33. Jewell JL, Guan K-L. Nutrient signaling to mTOR and cell growth. Trends Biochem Sci 16:1–10, 2013.

34. Kasuga M, Zick Y, Blith DL, Karlsson Fa, Häring HU, Kahn CR. Insulin stimulation of phosphorylation of the beta subunit of the insulin receptor. Formation of both phosphoserine and phosphotyrosine. J Biolog Chem 257(17):9891–4, 1982.

35. Katschinski DM. In vivo functions of the prolyl-4-hydroxylase domain oxygen sensors: direct route to the treatment of anaemia and the protection of ischaemic tissues. Acta Physiol (Oxford, England) 195(4):407–14, 2009.

36. Kimball SR, Farrell PA, Jefferson LS. Invited Review: Role of insulin in translational control of protein synthesis in skeletal muscle by amino acids or exercise. J Appl Physiol 93:1168-1180, 2002.

37. Kimball SR, Jefferson LS. Signaling pathways and molecular mechanisms through which branched-chain amino acids mediate translational control of protein synthesis. J Nutr 136:227S-231S, 2006.

38. Koumenis C, Wouters BG. "Translating" tumor hypoxia: unfolded protein response (UPR)-dependent and UPR-independent pathways. Mol Cancer Res 4(7):423–36, 2006.

39. Land SC, Tee AR. Hypoxia-inducible factor 1alpha is regulated by the mammalian target of rapamycin (mTOR) via an mTOR signaling motif. J Biol Chem 282(28):20534–43, 2007.

 

40. Li F, Yin Y, Tan B, Kong X, Wu G. Leucine nutrition in animals and humans: mTOR signaling and beyond. Amino Acids 41(5):1185–1193, 2011.

41. Liu L, Cash TP, Jones RG, Keith B, Thompson CB, Simon MC. Hypoxia-induced energy stress regulates mRNA translation and cell growth. Mol Cell 21(4):521–31, 2006.

42. Lundby C, Pilegaard H, Andersen JL, van Hall G, Sander M, Calbet JaL. Acclimatization to 4100 m does not change capillary density or mRNA expression of potential angiogenesis regulatory factors in human skeletal muscle. J Exp Biol 207(Pt 22):3865–71, 2004.

43. Lynch CJ, Gern B, Lloyd C, Hutson SM, Eicher R, Vary TC. Leucine in food mediates some of the postprandial rise in plasma leptin concentrations. Am J Physiol-Endoc M 291(3):E621–30, 2006.

44. MacDougall JD, Green HJ, Sutton JR, Coates G, Cymerman A, Young P, Houston CS. Operation Everest II: structural adaptations in skeletal muscle in response to extreme simulated altitude. Acta Physiol Scand 142:421-427, 1991.

45. Matsuura H, Ichiki T, Inoue E, Nomura M, Miyazaki R, Hashimoto T, Ikeda J, Takayanagi R, Fong G-H, Sunagawa K. Prolyl Hydroxylase Domain Protein 2 Plays a Critical Role in Diet-induced Obesity and Glucose Intolerance. Circulation, 2013

46. Mizuno M, Savard GK, Areskog N-H, Lundby C, Saltin B. Skeletal Muscle Adaptations to Prolonged Exposure to Extreme Altitude: A Role of Physical Activity? High Alt Med Biol 9(4):311-317, 2008.

47. Murray AJ. Metabolic adaptation of skeletal muscle to high altitude hypoxia: how new technologies could resolve the controversies. Genome Med, 1(12):117, 2009.

48. Naik R, Won M, Kim B-K, Xia Y, Choi HK, Jin G, Jung Y, et al. Synthesis and Structure-Activity Relationship of (E)-Phenoxyacrylic Amide Derivatives as Hypoxia-Inducible Factor (HIF) 1α Inhibitors. J Med Chem, 2012.

49. Nojima H, Tokunaga C, Eguchi S, Oshiro N, Hidayat S, Yoshino K, Hara K, et al. The mammalian target of rapamycin (mTOR) partner, raptor, binds the mTOR substrates p70 S6 kinase and 4E-BP1 through their TOR signaling (TOS) motif. Journal Biol Chem 278(18):15461–4, 2003.

50. Plénier S, Walrand S, Noirt R, Cynober L, Moinard C. Effects of leucine and citrulline versus non-essential amino acids on muscle protein synthesis in fasted rat: a common activation pathway? Amino Acids, 2011.

51. Rivas DA, Lessard SJ, Coffey VG. mTOR function in skeletal muscle: a focal point for overnutrition and exercise. Appl Physiol Nutr Metab 34:807-816, 2009.

52. Rohde J, Heitman J, Cardenas ME. The TOR kinases link nutrient sensing to cell growth. J Biol Chem 276(13):9583–6, 2001.

 

53. Schols AMWJ, Broekhuizen R, Weling-Scheepers Ca, Wouters EF. Body composition and mortality in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Clin Nutr 82(1):53–9, 2005.

54. Schriever SC, Deutsch MJ, Adamski J, Roscher Aa, Ensenauer R. Cellular signaling of amino acids towards mTORC1 activation in impaired human leucine catabolism. J Nutr Biochem 1–8, 2012.

55. Schuit FC. Medische biochemie: Moleculaire benadering van de geneeskunde, 2000, p 634-655

56. Selvaraj A, Thomas G. Phosphatase 2A puts the brakes on mTORC1 nutrient signaling. Cell Metab 11(4):245–7, 2010.

57. Shay JES, Celeste Simon M. Hypoxia-inducible factors: crosstalk between inflammation and metabolism. Semin Cell Dev Biol 3(4):389–94, 2012.

58. Smith TG, Robbins Pa, Ratcliffe PJ. The human side of hypoxia-inducible factor. Brit J Haematol 141(3):325–34, 2008.

59. Webb JD, Coleman ML, Pugh CW. Hypoxia, hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing. Cell Mol Llife Sci 66(22):3539–54, 2009.

60. Weigl LG. Lost in translation: regulation of skeletal muscle protein synthesis. Curr Opin Pharmacol 12(3):377–82, 2012.

61. Yan L, Mieulet V, Burgess D, Findlay GM, Sully K, Procter J, Goris J, et al. PP2A T61 epsilon is an inhibitor of MAP4K3 in nutrient signaling to mTOR. Mol Cell 37(5):633–42, 2010.

62. Yoshizawa F, Kimball SR, Vary TC, Jefferson LS. Effect of dietary protein on translation initiation in rat skeletal muscle and liver. Am J Physiol 275:E814-E820, 1998.

63. Zhang Y, Guo K, Leblanc RE, Loh D, Schwartz GJ, Yu Y. Increasing dietary leucine intake reduces diet-induced obesity and improves glucose and cholesterol metabolism in mice via multimechanisms. Diabetes 56(6):1647–1654, 2007.

Universiteit of Hogeschool
Master of science in de revalidatiewetenschappen en kinesitherapie
Publicatiejaar
2013
Kernwoorden
Share this on: