ENU mutagenesis as a discovery and validation tool of potential driver genes in pancreatic tumourigenesis.
Ontdekking nieuw gen geeft hoop in ontrafeling pancreaskanker.
Wat hebben Luciano Pavarotti, Steve Jobbs, Patrick Swayze en Joan Crawford met elkaar gemeen op hun bekendheid na? Ze stierven allen aan pancreaskanker. Hoewel pancreaskanker niet behoort tot de top 10 van de meest voorkomende kankergevallen in België, is het de 4de hoogste kanker-gerelateerde doodsoorzaak in de wereld. Kersvers VUB-alumnus Mathias Van Bulck legde zijn master thesis jaar af aan het gerenommeerde Australische ‘Garvan Institute of Medical Research’ waar hij onder leiding van Prof. Dr. Ilse Rooman en haar team onderzoek deed naar de ontwikkeling en progressie van deze ziekte d.m.v. muismodellen. Een hogere expressie van het nieuwe gen GUCD1 zou een rol spelen in het ontstaan van de omstandigheden die de aanzet voor pancreaskanker vormen.
De pancreas, een vitaal orgaan.
De pancreas bestaat uit een exocrien deel, verantwoordelijk voor de productie en het transport van spijsverteringsenzymen en een endocrien deel, dat instaat voor het op peil houden van de bloedsuiker. Het exocrien deel bevat verschillende functionele eenheden die op hun beurt uit cellen bestaan die een bepaalde taak hebben. Duct cellen zijn gegroepeerd in kanalen (ducti) die zorgen voor het transport van enzymen geproduceerd door acinaire cellen.
Pancreaskanker, niet zo onbenullig.
Ductaal pancreas adenocarcinoom (PDAC) is de meest voorkomende vorm van pancreaskanker. Bij diagnose hebben patiënten een gemiddelde levensverwachting van 6 maanden. Wat niet onverklaarbaar is. Wetende dat patiënten met pancreaskanker vijf jaar na diagnose een overlevingskans van slechts vijf procent hebben. Het voorkomen van de ziekte vóór de leeftijd van 40 jaar is zeldzaam aangezien de gemiddelde leeftijd van diagnose 70 jaar is. Gekende risicofactoren zijn roken, overgewicht, chronische inflammatie van de pancreas, familiegeschiedenis en een diabetis verleden. “Een vroege opsporing en betere behandeling is daarom broodnodig om de levensverwachting te verbeteren” aldus promotor en hoofd van de ‘Pancreatic tumourigenesis group’ Prof. Dr. I. Rooman. Dit kan enkel door het verkrijgen van fundamentele inzichten in het ontstaan van de kanker en hoe men deze zo vroeg mogelijk kan opsporen.
Muizen brengen verduidelijking.
Recente analyses in muismodellen van PDAC toonden aan dat duct-achtige tumoren kunnen ontstaan uit acinaire cellen via een mechanisme van acinaire-ductale metaplasie (ADM). ADM houdt in dat acinaire cellen worden omgezet naar cellen met duct-achtige eigenschappen. Het ontdekken van genen die verantwoordelijk zijn voor deze omzetting oftewel de aanzet van een tumor gevoelige omgeving kan informatief zijn voor nieuwe detectie- en behandelingsstrategieën.
Om deze genen te ontdekken en valideren gebruikten we een techniek, genaamd N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) mutagenese, die willekeurige mutaties aanbrengt in het genoom van muizen. Deze muizen dienden als basis voor het ontdekken en valideren van genen die potentieel betrokken zijn in ADM en de ontwikkeling van PDAC. We integreerden deze data met resultaten van DNA-sequentie en proteine analyse in tumorstalen van patiënten.
In de ontdekkingsstrategie ondergingen muizen een ‘forward’ ENU mutagenese, waarna het nageslacht van deze muizen werd onderzocht op ADM en verhoogde celdeling in de pancreas. Vervolgens werd next generation sequencing (NGS), een techniek die DNA sequenties op grote schaal vermenigvuldigt, van de muizen met een abnormaal uitziende pancreas gebruikt om de gemuteerde genen op te sporen.
Verder onderzoek van de aangetaste muizenstamboom correleerde de muizen met een abnormaal uitziende pancreas, met één bepaalde mutatie in het ongekarakteriseerde gen GUCD1. Mutaties in dit gen bevonden zich in een zeer geconserveerd functionele regio van het gen en werden 'waarschijnlijk schadelijk' bevonden door computer gebaseerde voorspellingsmethoden.
Onderzoek op pancreascellen afkomstig van GUCD1 mutante muizen geanalyseerd in een specifieke in vitro ADM test vertoonden hogere expressie van GUCD1 en transcriptiefactor Sox9, een ductaal gen dat sterk gekoppeld is aan ADM en PDAC ontwikkeling alsook een verlaging van een acinaire transcriptiefactor (Ptf1a), nodig voor de ontwikkeling van het exocriene deel van de pancreas en het verteringsenzyme amylase. GUCD1 expressie uit stalen van patiënten met pancreaskanker bleek omgekeerd evenredig te zijn met de respectievelijke overleving van deze patiënten. Analyse van het GUCD1 mRNA, de sequentie die omgezet wordt tot aminozuursequentie en aldus eiwitten, vertoonde echter een significante daling van pancreas tumorvorming in muismodellen. Overexpressie van GUCD1 (waarbij het gen op een kunstmatige manier tot hoge expressie komt) in de muis acinaire cellijn resulteerde niet in een verandering van het acinaire uitzicht van deze cellen.
In het validatieluik van deze thesis gebruikten we muizen met een reeds gekende ENU-geïnduceerde mutatie in het circadiaanse (slaap-waakritme) gen TIMELESS (TIM). Eerdere data toonden aan dat genetische afwijkingen in het TIM gen aanwezig zijn in ongeveer 10% van PDAC stalen van patiënten. Pancreascellen van mutante TIM muizen werden onderworpen aan de specifieke in-vitro ADM assay maar vertoonden geen verschillen in ADM-gerelateerde genexpressie, op een verhoging van Sox9 na. Deze voorlopige resultaten suggereren dat Tim niet uitgesproken betrokken is in ADM, wat een rol in de reeds gevormde tumor echter niet uitsluit.
Wat hebben we nu geleerd?
Het gebruik van mutagenese technieken in de studie van pancreaskanker kan zowel in een ontdekkings- als validatiestrategie tot nieuwe inzichten resulteren. Het Australische instituut wil met zijn nieuwste initiatief: ‘The Kinghorn Cancer Centre’ een voortrekker zijn in de ontwikkeling van ‘de therapie op maat’. Volgens M. Van Bulck kunnen de inzichten uit dit werk verder onderzoek sturen waardoor de gepersonaliseerde geneeskunde met een therapie op maat van de patiënt een stap dichterbij komt. Zowel onze aanpak met het oog op nieuwe ontdekkingen als deze voor validatie vereisen verdere functionele studies om de rol van GUCD1 en TIM in respectievelijk ADM en pancreaskanker ontwikkeling te definiëren.
Bibliografie
1. Jemal A. Global Cancer Statistics (vol 61, pg 69, 2011). Ca- Cancer J Clin. 2011 Mar;61:134–134.
2. Michl P, Gress TM. Current concepts and novel targets in advanced pancreatic cancer. Gut. 2013 Feb;62:317–26.
3. Lowenfels AB, Maisonneuve P. Epidemiology and risk factors for pancreatic cancer. Best Pr Res Clin Gastroenterol. 2006 Apr;20:197–209.
4. Michaud DS, Liu SM, Giovannucci E, Willett WC, Colditz GA, Fuchs CS. Dietary sugar, glycemic load, and pancreatic cancer risk in a prospective study. J Natl Cancer I. 2002 Sep 4;94:1293–300.
5. Michaud DS, Giovannucci E, Willett WC, Colditz GA, Stampfer MJ, Fuchs CS. Physical activity, obesity, height, and the risk of pancreatic cancer. JAMA. 2001 Aug 22;286:921–9.
6. Burris HA, Moore MJ, Andersen J, Green MR, Rothenberg ML, Modiano MR, et al. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial. J Clin Oncol. 1997 Jun;15:2403–13.
7. Hezel AF, Kimmelman AC, Stanger BZ, Bardeesy N, Depinho RA. Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma. Genes Dev. 2006 May 15;20:1218–49.
8. Morris JP, Cano DA, Selkine S, Wang SC, Hebrok M. beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. J Clin Invest. 2010 Feb;120:508–20.
9. Zhu LQ, Shi GL, Schmidt CM, Hruban RH, Konieczny SF. Acinar cells contribute to the molecular heterogeneity of pancreatic intraepithelial neoplasia. Am J Pathol. 2007 Jul;171:263–73.
10. Lowenfels AB, Maisonneuve P, Cavallini G, Ammann RW, Lankisch PG, Andersen JR, et al. Pancreatitis and the Risk of Pancreatic-Cancer. N Engl J Med. 1993 May 20;328:1433–7.
11. Feldmann G, Beaty R, Hruban RH, Maitra A. Molecular genetics of pancreatic intraepithelial neoplasia. J Hepatobiliary Pancreat Surg. 2007;14:224–32.
12. Kanda M, Matthaei H, Wu J, Hong SM, Yu J, Borges M, et al. Presence of Somatic Mutations in Most Early-Stage Pancreatic Intraepithelial Neoplasia. Gastroenterology. 2012 Apr;142:730–U129.
13. Hruban RH, Goggins M, Parsons J, Kern SE. Progression model for pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 2000 Aug;6:2969–72.
14. Caldas C, Kern SE. K-Ras Mutation and Pancreatic Adenocarcinoma - State-of-the-Art. Int J Pancreatol. 1995 Aug;18:1–6.
15. Maitra A, Hruban RH. Pancreatic cancer. Annu Rev Pathol-Mech Dis. 2008;3:157–88.
16. Carriere C, Young AL, Gunn JR, Longnecker DS, Korc M. Acute pancreatitis markedly accelerates pancreatic cancer progression in mice expressing oncogenic Kras. Biochem Biophys Res Commun. 2009 May 8;382:561–5.
17. Guerra C, Schuhmacher AJ, Canamero M, Grippo PJ, Verdaguer L, Perez-Gallego L, et al. Chronic pancreatitis is essential for induction of pancreatic ductal adenocarcinorna by k-Ras Oncogenes in adult mice. Cancer Cell. 2007 Mar;11:291–302.
18. Morris JP, Wang SC, Hebrok M. KRAS, Hedgehog, Wnt and the twisted developmental biology of pancreatic ductal adenocarcinoma. Nat Rev Cancer. 2010 Oct;10:683–95.
19. Kopp JL, von Figura G, Mayes E, Liu F-F, Dubois CL, Morris JP, et al. Identification of Sox9-Dependent Acinar-to-Ductal Reprogramming as the Principal Mechanism for Initiation of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 2012 Dec 11;22(6):737–50.
20. Pinho AV, Rooman I, Reichert M, De Medts N, Bouwens L, Rustgi AK, et al. Adult pancreatic acinar cells dedifferentiate to an embryonic progenitor phenotype with concomitant activation of a senescence programme that is present in chronic pancreatitis. Gut. 2011 Jul;60:958–66.
21. Rooman I, Real FX. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development? Gut. 2012 Mar;61:449–58.
22. Bockman DE, Guo JC, Buchler P, Muller MW, Bergmann F, Friess H. Origin and development of the precursor lesions in experimental pancreatic cancer in rats. Lab Invest. 2003 Jun;83:853–9.
23. Scarpelli DG, Rao MS, Reddy JK. Studies of Pancreatic Carcinogenesis in Different Animal-Models. Env Heal Perspect. 1984;56:219–27.
24. Wagner M, Luhrs H, Kloppel G, Adler G, Schmid RM. Malignant transformation of duct-like cells originating from acini in transforming growth factor a transgenic mice. Gastroenterology. 1998 Nov;115:1254–62.
25. Sandgren EP, Quaife CJ, Paulovich AG, Palmiter RD, Brinster RL. Pancreatic Tumor Pathogenesis Reflects the Causative Genetic Lesion. Proc Natl Acad Sci U S. 1991 Jan;88:93–7.
26. Hingorani SR, Petricoin EF, Maitra A, Rajapakse V, King C, Jacobetz MA, et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 2003 Dec;4:437–50.
27. Bardeesy N, Sharpless NE. RAS unplugged: Negative feedback and oncogene-induced senescence. Cancer Cell. 2006 Dec;10:451–3.
28. Guerra C, Barbacid M. Genetically engineered mouse models of pancreatic adenocarcinoma. Mol Oncol. 2013 Apr;7:232–47.
29. Hingorani SR, Wang LF, Multani AS, Combs C, Deramaudt TB, Hruban RH, et al. Trp53(R172H) and KraS(G12D) cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 2005 May;7:469–83.
30. Biankin AV, Waddell N, Kassahn KS, Gingras MC, Muthuswamy LB, Johns AL, et al. Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes. Nature. 2012 Nov 15;491:399–405.
31. Franceschini A, Szklarczyk D, Frankild S, Kuhn M, Simonovic M, Roth A, et al. STRING v9.1: protein-protein interaction networks, with increased coverage and integration. Nucleic Acids Res. 2013 Jan;41:D808–D815.
32. Kondratov RV, Antoch MP. Circadian proteins in the regulation of cell cycle and genotoxic stress responses. Trends Cell Biol. 2007 Jul;17:311–7.
33. Gotter AL, Manganaro T, Weaver DR, Kolakowski LF, Possidente B, Sriram S, et al. A time-less function for mouse Timeless. Nat Neurosci. 2000 Aug;3:755–6.
34. Chan RC, Chan A, Jeon M, Wu TF, Pasqualone D, Rougvie AE, et al. Chromosome cohesion is regulated by a clock gene paralogue TIM-1. Nature. 2003 Jun 26;423:1002–9.
35. Davis S, Mirick DK, Stevens RG. Night Shift Work, Light at Night, and Risk of Breast Cancer. J Natl Cancer Inst. 2001 Oct 17;93:1557–62.
36. Kemp MG, Akan Z, Yilmaz S, Grillo M, Smith-Roe SL, Kang T-H, et al. Tipin-Replication Protein A Interaction Mediates Chk1 Phosphorylation by ATR in Response to Genotoxic Stress. J Biol Chem. 2010 May 28;285(22):16562–71.
37. Nguyen N, Judd LM, Kalantzis A, Whittle B, Giraud AS, van Driel IR. Random mutagenesis of the mouse genome: a strategy for discovering gene function and the molecular basis of disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011 Jan;300:G1–11.
38. Noveroske JK, Weber JS, Justice MJ. The mutagenic action of N-ethyl-N-nitrosourea in the mouse. Mamm Genome. 2000 Jul;11:478–83.
39. Takahasi KR, Sakuraba Y, Gondo Y. Mutational pattern and frequency of induced nucleotide changes in mouse ENU mutagenesis. Bmc Mol Biol [Internet]. 2007 Jun 20;8. Available from: ://000248094500001
40. Andrews TD, Whittle B, Field MA, Balakishnan B, Zhang Y, Shao Y, et al. Massively parallel sequencing of the mouse exome to accurately identify rare, induced mutations: an immediate source for thousands of new mouse models. Open Biol [Internet]. 2012 May;2. Available from: ://000307112900001
41. Nelms KA, Goodnow CC. Genome-wide ENU mutagenesis to reveal immune regulators. Immunity. 2001 Sep;15:409–18.
42. Giry-Laterriere M, Cherpin O, Kim YS, Jensen J, Salmon P. Polyswitch Lentivectors: “All-in-One” Lentiviral Vectors for Drug-Inducible Gene Expression, Live Selection, and Recombination Cloning. Hum Gene Ther. 2011 Oct;22:1255–67.
43. Shin K-J, Wall EA, Zavzavadjian JR, Santat LA, Liu J, Hwang J-I, et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci. 2006 Sep 12;103:13759–64.
44. Ornitz DM, Palmiter RD, Messing A, Hammer RE, Pinkert CA, Brinster RL. Elastase I promoter directs expression of human growth hormone and SV40 T antigen genes to pancreatic acinar cells in transgenic mice. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1985;50:399–409.
45. Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics. 2008;9:40.
46. Roy A, Kucukural A, Zhang Y. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. Nat Protoc. 2010;5:725–38.
47. Cerami E, Gao J, Dogrusoz U, Gross BE, Sumer SO, Aksoy BA, et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discov. 2012 May;2:401–4.
48. Adzhubei IA, Schmidt S, Peshkin L, Ramensky VE, Gerasimova A, Bork P, et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat Methods. 2010 Apr;7:248–9.
49. Jones S, Zhang XS, Parsons DW, Lin JCH, Leary RJ, Angenendt P, et al. Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses. Science. 2008 Sep 26;321:1801–6.
50. Potter LR. Guanylyl cyclase structure, function and regulation. Cell Signal. 2011 Dec;23(12):1921–6.
51. Pitari GM, Di Guglielmo MD, Park J, Schulz S, Waldman SA. Guanylyl cyclase C agonists regulate progression through the cell cycle of human colon carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci. 2001 Jul 3;98(14):7846–51.
52. Delous M, Yin C, Shin D, Ninov N, Debrito Carten J, Pan L, et al. sox9b Is a Key Regulator of Pancreaticobiliary Ductal System Development. PLoS Genet. 2012 Jun 14;8(6):e1002754.
53. Manfroid I, Ghaye A, Naye F, Detry N, Palm S, Pan L, et al. Zebrafish sox9b is crucial for hepatopancreatic duct development and pancreatic endocrine cell regeneration. Dev Biol. 2012 Jun 15;366(2):268–78.
54. Shi G, Zhu L, Sun Y, Bettencourt R, Damsz B, Hruban RH, et al. Loss of the Acinar-Restricted Transcription Factor Mist1 Accelerates Kras-Induced Pancreatic Intraepithelial Neoplasia. Gastroenterology. 2009 Apr 1;136(4):1368–78.
