“Ik heb nog nooit een suikerboom gezien, in welk sprookjesland komen deze voor?” hoor ik u al vragen. Deze bomen bezetten het oppervlak van eiwitten, dus niet meteen vergelijkbaar met een doordeweekse berk of beuk. Recent werd een technologie ontwikkeld om deze suikerbomen weg te maaien. Een vorm van ontbossing met vele voordelen, vooral in de farmaceutische industrie.
Eiwitten zijn één van de voornaamste bouwstenen van ons lichaam, ze komen voor in en op elke cel en stromen rijkelijk in het bloed. Vroeger werd reeds gedacht dat eiwitten als medicatie zouden kunnen gebruikt worden. In de laatste jaren is dit ook werkelijkheid geworden met als resultaat dat er vandaag de dag meer dan 200 therapeutische eiwitten op de markt zijn. Eén belangrijk voorbeeld is ‘Etanercept’, een eiwit voor behandeling van reuma.
Deze therapeutische eiwitten hebben duidelijk aan belang gewonnen, maar de productie ervan is echter nog steeds een uitdaging. De biofarmaceutische industrie gebruikt hiervoor vooral zoogdiercellijnen, dus ook menselijke cellijnen. Deze cellen decoreren het oppervlak van de geproduceerde eiwitten met zeer variabele suikerbomen. Daarenboven wordt de vorm van deze suikerstructuren extra beïnvloed door parameters waaronder de cellen worden gegroeid, zoals zuurtegraad en temperatuur. Het geproduceerde therapeuticum is dus een mengsel van eenzelfde eiwit met suikerbomen die verschillen in het aantal vertakkingen. De dienst Volksgezondheid eist dat het product steeds dezelfde kwaliteit heeft, maar de variabiliteit van suikerbomen maakt dit niet eenvoudig.
Ernstiger is wanneer een biofarmaceuticum, zoals een vaccin, zijn therapeutische werking verliest omwille van de aangehechte suikerbomen. Elk jaar moet u een nieuw griepvaccin krijgen omdat hetgeen dat u vorig jaar kreeg geen bescherming meer biedt. Hoe kan dat nu? Influenza is één van die snel veranderende virussen. Het virus trekt als het ware elk jaar een ander jasje aan. Deze mantel bestaat uit eiwitten. Op deze eiwitten zijn wel patronen die minder snel veranderen. Vaccins die een immuunrespons opwekken tegen deze patronen zouden een langdurige bescherming kunnen bieden tegen het virus. Het virus heeft echter die meer geconserveerde patronen bomvol suikerbomen gezet. Deze suikerbomen fungeren als een soort paraplu waaronder de patronen verscholen worden voor ons immuunstelsel.
Als deze suikerbomen zoveel problemen veroorzaken, waarom maaien we deze dan niet gewoon weg? Suikerbomen hebben een belangrijke functie in het vouwen van de eiwitten tot de juiste vorm en kunnen niet zomaar verwijderd worden. Na correcte opvouwing hebben de meeste suikerstructuren slechts een beperkte functie. Dus nadat ze hun cruciale rol in eiwitopvouwing gespeeld hebben zouden ze eventueel verwijderd kunnen worden.
Recent werd de GlycoDelete-technologie ontwikkeld die exact dit doet. Bij deze technologie werd in een menselijke cellijn via genetische manipulatie een soort kettingzaag (een endoglycosidase) ingebouwd. Het endoglycosidase kapt suikerbomen om die op het oppervlak van eiwitten zitten. Maar dit endoglycosidase vereist dat deze suikerbomen allemaal van dezelfde vorm zijn. Dit wordt verkregen door extra genetische modificatie van de menselijke cellijn. Concreet werd een gen dat instaat voor het veranderen van de vorm van de suikerboom verwijderd.
Vooral de farmaceutische industrie toont interesse in deze technologie, maar de GlycoDelete-technologie is tot op heden nog niet zo makkelijk in gebruik en moest daarom geoptimaliseerd worden. Vooral de extra modificatie om alle suikerbomen van dezelfde vorm te maken, is niet goedkoop en niet eenvoudig. In deze thesis werden verschillende soorten endoglycosidasen getest. Een bepaalde variant van endoglycosidasen bleek bovenverwachte activiteit te vertonen. Dit endoglycosidase kon alle vormen van suikerbomen verwijderen. Het endoglycosidase werd verder gekarakteriseerd en tot dusver zijn de eerste resultaten veelbelovend.
Er werd dus een ‘shortcut’ gevonden in de GlycoDelete-technologie die deze makkelijker, sneller en goedkoper kan maken. Dit kan het duwtje in de rug zijn zodat de technologie ingang vindt in de farmaceutische industrie, waardoor goedkopere en efficiëntere medicatie kan gevonden worden.
Alduaij W, Ivanov A, Honeychurch J, Cheadle EJ, Potluri S, Lim SH, Shimada K, Chan CHT, Tutt A, Beers SA, Glennie MJ, Cragg MS & Illidge TM (2011) Novel type II anti-CD20 monoclonal antibody (GA101) evokes homotypic adhesion and actin-dependent, lysosome-mediated cell death in B-cell malignancies. Blood 117: 4519–4529
Aujla SJ, Chan YR, Zheng M, Fei M, Askew DJ, Pociask DA, Reinhart TA, McAllister F, Edeal J, Gaus K, Husain S, Kreindler JL, Dubin PJ, Pilewski JM, Myerburg MM, Mason CA, Iwakura Y & Kolls JK (2008) IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat. Med. 14: 275–281
Baneyx F & Mujacic M (2004) Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 22: 1399–1408
Boniface K, Guignouard E, Pedretti N, Garcia M, Delwail A, Bernard F-X, Nau F, Guillet G, Dagregorio G, Yssel H, Lecron J-C & Morel F (2007) A role for T cell-derived interleukin 22 in psoriatic skin inflammation. Clin. Exp. Immunol. 150: 407–415
Butler M (2005) Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68: 283–291
Byrne B, Donohoe GG & O’Kennedy R (2007) Sialic acids: carbohydrate moieties that influence the biological and physical properties of biopharmaceutical proteins and living cells. Drug Discov. Today 12: 319–326
Chu L & Robinson DK (2001) Industrial choices for protein production by large-scale cell culture. Curr. Opin. Biotechnol. 12: 180–187
Collin M & Olsén A (2001) EndoS, a novel secreted protein from Streptococcus pyogenes with endoglycosidase activity on human IgG. Embo J. 20: 3046–3055
Cummings RD & Etzler ME (2009) Boek: Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. In Essentials of Glycobiology, Varki A Cummings RD Esko JD Freeze HH Stanley P Bertozzi CR Hart GW & Etzler ME (eds) Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press
Dean FB, Bullock P, Murakami Y, Wobbe CR, Weissbach L & Hurwitz J (1987) Simian virus 40 (SV40) DNA replication: SV40 large T antigen unwinds DNA containing the SV40 origin of replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 16–20
Delannoy P, Kim I, Emery N, De Bolos C, Verbert A, Degand P & Huet G (1996) Benzyl-N-acetyl-alpha-D-galactosaminide inhibits the sialylation and the secretion of mucins by a mucin secreting HT-29 cell subpopulation. Glycoconj. J. 13: 717–726
Disis ML, Bernhard H, Shiota FM, Hand SL, Gralow JR, Huseby ES, Gillis S & Cheever MA (1996) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines. Blood 88: 202–210
Forno G, Bollati Fogolin M, Oggero M, Kratje R, Etcheverrigaray M, Conradt HS & Nimtz M (2004) N- and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line. Eur. J. Biochem. 271: 907–919
Fujita K, Kobayashi K, Iwamatsu A, Takeuchi M, Kumagai H & Yamamoto K (2004) Molecular cloning of Mucor hiemalis endo-β-N-acetylglucosaminidase and some properties of the recombinant enzyme. Arch. Biochem. Biophys. 432: 41–49
Garrido D, Nwosu C, Ruiz-Moyano S, Aldredge D, German JB, Lebrilla CB & Mills DA (2012) Endo-β-N-acetylglucosaminidases from Infant Gut-associated Bifidobacteria Release Complex N-glycans from Human Milk Glycoproteins. Mol. Cell. Proteomics 11: 775–785
Glennie MJ, French RR, Cragg MS & Taylor RP (2007) Mechanisms of killing by anti-CD20 monoclonal antibodies. Mol. Immunol. 44: 3823–3837
Goetze AM, Liu YD, Zhang Z, Shah B, Lee E, Bondarenko PV & Flynn GC (2011) High-mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology 21: 949–959
Goodfellow JJ, Baruah K, Yamamoto K, Bonomelli C, Krishna B, Harvey DJ, Crispin M, Scanlan CN & Davis BG (2012) An Endoglycosidase with Alternative Glycan Specificity Allows Broadened Glycoprotein Remodelling. J. Am. Chem. Soc. 134: 8030–8033
Hale BG, Randall RE, Ortín J & Jackson D (2008) The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses. J. Gen. Virol. 89: 2359–2376
Hanson SR, Culyba EK, Hsu T-L, Wong C-H, Kelly JW & Powers ET (2009) The core trisaccharide of an N-linked glycoprotein intrinsically accelerates folding and enhances stability. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106: 3131–3136
Helenius A & Aebi and M (2001) Intracellular Functions of N-Linked Glycans. Science 291: 2364–2369
Jacobs PP (2008) Doctoraat: Glycosylation and cell surface engineering in Pichia Pastoris.
Jacobs PP, Geysens S, Vervecken W, Contreras R & Callewaert N (2009) Engineering complex-type N-glycosylation in Pichia pastoris using GlycoSwitch technology. Nat. Protoc. 4: 58–70
Kanda Y, Yamada T, Mori K, Okazaki A, Inoue M, Kitajima-Miyama K, Kuni-Kamochi R, Nakano R, Yano K, Kakita S, Shitara K & Satoh M (2007) Comparison of biological activity among nonfucosylated therapeutic IgG1 antibodies with three different N-linked Fc oligosaccharides: the high-mannose, hybrid, and complex types. Glycobiology 17: 104–118
Laurence A, O’Shea JJ & Watford WT (2008) Interleukin-22: a sheep in wolf’s clothing. Nat. Med. 14: 247–249
Li H & d’ Anjou M (2009) Pharmacological significance of glycosylation in therapeutic proteins. Curr. Opin. Biotechnol. 20: 678–684
Lynd LR, Weimer PJ, Zyl WH van & Pretorius IS (2002) Microbial Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66: 506–577
Metcalf D (1986) The molecular biology and functions of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factors. Blood 67: 257–267
Meuris L (2012) Doctoraat: GlycoDelete: a new glycoengineering concept for protein production in mammalian cells.
Noll T (2010) Cells and Culture: Proceedings of the 20th ESACT Meeting, Dresden, Germany, June 17-20, 2007 Springer
Patnaik SK & Stanley P (2006) Lectin‐Resistant CHO Glycosylation Mutants. In Methods in Enzymology, Minoru Fukuda (ed) pp 159–182. Academic Press
Pickert G, Neufert C, Leppkes M, Zheng Y, Wittkopf N, Warntjen M, Lehr H-A, Hirth S, Weigmann B, Wirtz S, Ouyang W, Neurath MF & Becker C (2009) STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. J. Exp. Med. 206: 1465–1472
Rao V, Guan C & Roey PV (1995) Crystal structure of endo-β-N-acetylglucosaminidase H at 1.9 å resolution: active-site geometry and substrate recognition. Structure 3: 449–457
Reeves PJ, Callewaert N, Contreras R & Khorana HG (2002) Structure and function in rhodopsin: High-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 13419–13424
Santens F (2010) IWT-project: Biofarmaceutische eiwitten: glyco-engineeringtechnologie voor de productie van verbeterde, homogene glycovormen.
Stals I, Karkehabadi S, Kim S, Ward M, Van Landschoot A, Devreese B & Sandgren M (2012) High Resolution Crystal Structure of the Endo-N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase Responsible for the Deglycosylation of Hypocrea jecorina Cellulases. Plos One 7:
Stals I, Samyn B, Sergeant K, White T, Hoorelbeke K, Coorevits A, Devreese B, Claeyssens M & Piens K (2010) Identification of a gene coding for a deglycosylating enzyme in Hypocrea jecorina. Fems Microbiol. Lett. 303: 9–17
Steentoft C, Vakhrushev SY, Vester-Christensen MB, Schjoldager KT-BG, Kong Y, Bennett EP, Mandel U, Wandall H, Levery SB & Clausen H (2011) Mining the O-glycoproteome using zinc-finger nuclease–glycoengineered SimpleCell lines. Nat. Methods 8: 977–982
Sugimoto K, Ogawa A, Mizoguchi E, Shimomura Y, Andoh A, Bhan AK, Blumberg RS, Xavier RJ & Mizoguchi A (2008) IL-22 ameliorates intestinal inflammation in a mouse model of ulcerative colitis. J. Clin. Invest. 118: 534–544
Tarentino AL, Plummer TH & Maley F (1974) The Release of Intact Oligosaccharides from Specific Glycoproteins by Endo-β-N-acetylglucosaminidase H. J. Biol. Chem. 249: 818–824
Tarentino AL, Quinones G, Changchien LM & Plummer TH (1993) Multiple endoglycosidase F activities expressed by Flavobacterium meningosepticum endoglycosidases F2 and F3. Molecular cloning, primary sequence, and enzyme expression. J. Biol. Chem. 268: 9702–9708
Taylor ME & Drickamer K (2011) Boek: Introduction to glycobiology Oxford; New York: Oxford University Press
Tiels P, Baranova E, Piens K, De Visscher C, Pynaert G, Nerinckx W, Stout J, Fudalej F, Hulpiau P, Tännler S, Geysens S, Van Hecke A, Valevska A, Vervecken W, Remaut H & Callewaert N (2012) A bacterial glycosidase enables mannose-6-phosphate modification and improved cellular uptake of yeast-produced recombinant human lysosomal enzymes. Nat. Biotechnol. 30: 1225–1231
Trimble RB & Tarentino AL (1991) Identification of distinct endoglycosidase (endo) activities in Flavobacterium meningosepticum: endo F1, endo F2, and endo F3. Endo F1 and endo H hydrolyze only high mannose and hybrid glycans. J. Biol. Chem. 266: 1646–1651
Waddling CA, Plummer TH Jr, Tarentino AL & Van Roey P (2000) Structural basis for the substrate specificity of endo-beta-N-acetylglucosaminidase F(3). Biochemistry (Mosc.) 39: 7878–7885
Walsh G (2010) Biopharmaceutical benchmarks 2010. Nat. Biotechnol. 28: 917–924
Walter MR, Cook WJ, Ealick SE, Nagabhushan TL, Trotta PP & Bugg CE (1992) Three-dimensional structure of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. J. Mol. Biol. 224: 1075–1085
Wang C-C, Chen J-R, Tseng Y-C, Hsu C-H, Hung Y-F, Chen S-W, Chen C-M, Khoo K-H, Cheng T-J, Cheng Y-SE, Jan J-T, Wu C-Y, Ma C & Wong C-H (2009) Glycans on influenza hemagglutinin affect receptor binding and immune response. Proc. Natl. Acad. Sci.
Website: Carbohydrate Active Enzymes, 2013 Available at: Http://www.cazy.org [Accessed April 21, 2013]
Website: Consortium for Functional Glycomics, 2013 Available at: http://www.functionalglycomics.org/ [Accessed April 21, 2013]
Website: Sigma-Aldrich, 2013 Sigma-Aldrich Available at: http://www.sigmaaldrich.com/belgium-nederlands.html [Accessed April 21, 2013]
Website: Wikimedia, 2009 Available at: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fischer_projection_of_D-aldoses1… [Accessed April 21, 2013a]
Website: Wikimedia, 2009 Available at: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Beta-D-Glucose.svg [Accessed April 21, 2013b]
Website: Wikimedia, 2009 Available at: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Alpha-D-Glucose.svg [Accessed April 21, 2013c]
Wesbite: GlycoPOD, 2012 Available at: http://jcggdb.jp/GlycoPOD/protocolListShow [Accessed April 21, 2013]
Wurm FM (2004) Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22: 1393–1398
Zenewicz LA, Yancopoulos GD, Valenzuela DM, Murphy AJ, Karow M & Flavell RA (2007) IL-22 but not IL-17 provides protection to hepatocytes during acute liver inflammation. Immunity 27: 647–659