Identificatie van de bacteriële gemeenschappen op marien plastic afval

Julie Muyle
Het dagelijks gebruik van plastic in onze maatschappij blijft toenemen terwijl deze synthetische polymeren nauwelijks degraderen. Daarom is het belangrijk de problematiek rond plastic zwerfvuil in het marien milieu in kaart te brengen. Zeer actueel zijn de trieste foto’s van door plastic afval verstrikte, verwonde, gestikte of uitgehongerde zeedieren. Dieper onderzoek is echter noodzakelijk om ook de impact van de kleinere plastic partikels zoals microplastics en nanoplastics te kunnen evalueren.

Identificatie van de bacteriële gemeenschappen op marien plastic afval

Het dagelijks gebruik van plastic in onze maatschappij blijft toenemen terwijl deze synthetische polymeren nauwelijks degraderen. Daarom is het belangrijk de problematiek rond plastic zwerfvuil in het marien milieu in kaart te brengen. Zeer actueel zijn de trieste foto’s van door plastic afval verstrikte, verwonde, gestikte of uitgehongerde zeedieren. Dieper onderzoek is echter noodzakelijk om ook de impact van de kleinere plastic partikels zoals microplastics en nanoplastics te kunnen evalueren. Deze partikels kunnen opgenomen worden door mariene organismen zoals de mossel waarna ze kunnen accumuleren in het weefsel. Persistente polluenten kunnen accumuleren op deze microplastics en een bijkomende impact uitoefenen op het mariene ecosysteem. Plastic afval en microplastics blijken eveneens als habitat te fungeren voor tal van mariene micro-organismen. Uit onderzoek blijkt dat sommige mariene bacteriën zelfs in staat zouden zijn de synthetische polymeren te biodegraderen. Hoe dit gebeurt en welke effecten dit zal hebben op het ecosysteem is echter nog een groot vraagteken.

Aangezien mariene bacteriën zeer moeilijk te cultiveren zijn, bestaat er een grote interesse naar het isoleren, cultiveren en identificeren van mariene bacteriën. In het kader van de Europese onderzoeksprojecten MICRO (InterReg 2 Zeeën) en CleanSea (7KP) wordt onderzoek verricht naar de identificatie van bacteriële gemeenschappen en bacteriële biodegradatie van marien plastic afval. Dit eindwerk behandelt verschillende methodes voor de identificatie van bacteriële gemeenschappen op microplastics, plastic strandafval en marien plastic zwerfvuil. Vervolgens wordt er nagegaan met een microkosmos experiment welke opportunistische bacteriën zich preferentieel op het plastic zullen hechten. Er zal gebruik gemaakt worden van zowel microbiologische als moleculair biotechnologische technieken om de isolatie, cultivatie en identificatie van mariene bacteriën te verwezenlijken.

Hiervoor worden verschillende opwerkingsmedia, voedingsbodems, incubatietijden en -temperaturen uitgetest. Na optimalisatie wordt besloten gebruik te maken van een isolatie in Maximum Recovery Diluent (MRD) met behulp van een vortex-methode en een cultivatie op Marine Agar (MA) en Plate Count Agar (PCA). Gegroeide kolonies worden vervolgens op twee manieren opgewerkt. In de eerste methode wordt een kolonie PCR uitgevoerd waarbij gescheiden kolonies aangeprikt worden en overgebracht worden in PCR mix. In de tweede methode worden volledige swabs afgenomen van de begroeide platen. Het geëxtraheerde DNA van de swabs wordt vervolgens geamplificeerd en gescheiden via denaturerende gradiënt gelelektroforese (DGGE). Enkele testen werden uitgevoerd waarbij DNA rechtstreeks zonder cultivatie geëxtraheerd werd uit de stalen met behulp van sonificatie of Retsch methode. Voor de identificatie wordt gebruik gemaakt van een amplificatie van de V3 regio op het 16S fragment. Opgezuiverde PCR fragmenten werden tot slot verzonden naar Macrogen waar ze gesequeneerd werden. Binnen de 24 uur waren de resultaten beschikbaar zijn voor een verdere data analyse. De verkregen sequenties werden vervolgens verwerkt met de gepaste software en geanalyseerd in de databank NCBI BLAST.

Het microkosmos experiment werd uitgevoerd in glazen 500 ml bokalen die gevuld worden met zeewater of sediment. Hierin werden vervolgens bacterievrije plastic pellets of synthetische vezels gebracht. Gedurende 1 maand werden deze plastic stukjes blootgesteld aan zeewater of sediment, waarbij 4 bemonsteringen plaatsvinden voor de identificatie van aanwezige bacteriën op het plastic.

Voor de cultivatie van mariene bacteriën blijkt MA het beste medium. Hierop werden 20 verschillende species geïdentificeerd terwijl er op PCA slechts 11 verschillende werden aangetroffen.

De geïdentificeerde bacteriën op het plastic afval behoren voornamelijk tot de klassen van de Gamma Proteobacteria, Actinobacteria, Bacilli en Flavobacteria. Vele aangetroffen bacteriën zoals Pseudoalteromonas sp., Acinetobacter sp., Alteromonas sp., Vibrio sp. en Psychrobacter sp. kunnen verwacht worden in een aquatisch milieu. Wat opvalt, is dat een aantal bacteriën, behorend tot de klasse van de Actinobacteria, enkel aangetroffen werden op de preproductie pellets van het strand, terwijl ze niet op het strandafval noch op het afval uit zee gevonden werden. Op marien afval werden enkel bacteriën geïdentificeerd die behoren tot de klasse van de Gammaproteobacteria. Enkele mariene soorten zoals Vibrio sp. en Shewanella sp. werden zelfs enkel teruggevonden op het plastic uit zee en kunnen niet in verband gebracht worden met het strandafval.

Uit het microkosmos experiment blijkt dat bacteriën uit het zeewater in staat zijn om het plastic te koloniseren. Bacteriën zoals Shewanella sp., Pseudoalteromonas sp. en Colwellia sp. werden geïdentificeerd als opportunistische soorten.

Dit eindwerk draagt bij tot de studie van de microbiële biodiversiteit en karakterisatie van het marien milieu, wat relevant is voor ondermeer de evaluatie van de zwemwaterkwaliteit en toepassingen binnen de aquacultuur sector. Dit eindwerk vormt een eerste stap in het onderzoek naar de topic bacteriële biodegradatie van marien plastic zwerfvuil.

Bibliografie

[1] Katz, S., Plastic History [www], 3 maart 2009, Plastipedia .

URL: http://www.bpf.co.uk/Plastipedia/Plastics_History/Default.aspx

Gezien d.d. 27 februari 2013

[2] Anoniem., Use of plastic [www], 2010, The Plastic Portal.

URL: http://www.plasticseurope.org/use-of-plastics.aspx

Gezien d.d. 27 februari 2013

[3] Anoniem., How plastics work [www], 2013, How stuff works.

URL: http://science.howstuffworks.com/plastic1.htm

Gezien d.d. 27 februari 2013

[4] Anoniem., what is plastic? [www], 2010, The Plastic Portal.

URL: http://www.plasticseurope.org/what-is-plastic/how-plastic-is-made.aspx

Gezien d.d. 26 maart 2013

[5] Anoniem., Marine litter [www], 18 maart 2013, European commission.

URL:http://ec.europa.eu/environment/marine/good-environmental-status/descri…

Gezien d.d. 26 maart 2013

[6] Anoniem., Sources of Marine Litter [www], 2013, United Nations Environment Programme.

URL: http://www.unep.org/regionalseas/marinelitter/about/sources/default.asp

Gezien d.d. 26 maart 2013

[7] Jeftic, L. Sheavly, S. Adler, E. (2009). Marine litter: A Global Challenge. United Nations Environment Programme, 232pp.

[8] Waterman, J. Invasive plastic hitchhikers [www], 15 oktober 2012, Ocean views, National geographic channel.

URL: http://newswatch.nationalgeographic.com/2012/10/15/invasive-plastic-hit…

Gezien d.d. 3 april 2013

[9] Dickens, P. Beach clean up - Cape Town [www], 11 april 2011, Stonedhogeblog.

URL: http://stonedhogblog.blogspot.be/

Gezien d.d. 3 april 2013

[10] Anoniem., Wildlife in the waste [www], 12 december 2010, Getting trashed.

URL: http://gettingtrashed.blogspot.be/2010/12/wildlife-in-waste.html

Gezien d.d. 3 april 2013

[11]Calus, B. Knapen, S. Mattijs, J. Van Aken, J. Plastieken zee [www], 2012, Associatie K.U. Leuven.

URL: http://telescript.denayer.wenk.be/2011-12/f1b/public_html/project.shtml

Gezien d.d. 3 april 2013

[12] Hoffman,D.Plastics Pandemic [www],24 juli 2008,365 words beginning with P.

URL: http://365pwords.wordpress.com/

Gezien d.d. 3 april 2013

[13] Mast, T. De Noordse Stormvogel is een vliegend vuilnisvat [www], 19 april 2012, Het Laatste Nieuws.

URL: http://www.hln.be/hln/nl/2661/Dieren/article/detail/1426180/2012/04/19/…

Gezien d.d. 3 april 2013

[14] Anoniem., Europa geeft aandacht aan vervuilende microplastics [www], 10 februari 2012, Plastic Soup Foundation.

URL: http://plasticsoupfoundation.org/nieuws/europa-geeft-aandacht-aan-micro…

Gezien d.d. 12 april 2013

[15] Derveaux, S. Devriese, L. Vethaak, D. Huvet, A. Robbens, J. Riebbels, G. Matthijs, F. Maes, T. (2013) Microplastics - Een bedreiging voor het 2-Zeeën gebied? Zeemaandelijks tijdschrift, 1, 1-4.

[16] Roex, D. Vethaak, D. Leslie, H. De Kreuk, M. Microplastics in het zoetwatermilieu - Een inventaris van mogelijke risico’s voor waterschappen. Stowa.

[17] Moos, N. et al. (2012) Uptake and effects of microplastics on cells and tissue of the blue mussel Mylitus edulis L. after an experimental exposure. Environmental Science & Technology. 11327-11335

[18] Teuten E. et al. (2007) Potential for plastics to transport hydrophobic contaminants. Environmental Science & Technology. 41. 7759-7764.

[19] Glöckner, F,O. Et al. (2012). Marine Microbial Diversity and its role in Ecosystem Functioning and Environmental Change. Marine Board, Position Paper 17. 7-73.

[20] Anoniem., Mariene microbiologie[www], 2012, Koninklijk Nederlands Instituut voor Onderzoek der Zee.

URL: http://www.nioz.nl/mm

Gezien d.d. 17 april 2013

[21] Zheng, Y. et al. (2005) A review of plastic waste biodegradation. Critical Reviews in Biotechnology, 25. 243-250.

[22] Zaikab, D, G. Marine mirobes digest plastic [www], 2011, Nature.

URL: http://www.nature.com/news/2011/110328/full/news.2011.191.html

Gezien d.d. 17 april 2013

[23] Pede, A. et al. (2013) Impact of phytoplankton Bloom deposition and concomitant metal fluxes on the composition and activity of benthic microbial communities in subtidal marine sediments: a microcosm study. PhD. Universiteit Gent.

[24] Harrison P, J. (2012), The spectroscopic detection and bacterial colonisation of synthetic microplastics in coastal marine sediments. Paper The university of Sheffield.

[25] Sudhakar, M. Doble, M. Murthy, S, P. Venkatesan, R. (2007). Marine microbe-mediated biodegradation of low- and high density polyethylenes. International Biodeterioration & Biodegradation, 61. 203-213.

[26] Sudhakar, M. et al. (2007). Biofouling and biodegradation of polyolefins in ocean waters. Polymer Degradation and Stability, 92. 1743-1752.

[27] Kathiresan, K. (2002). Polythene and Plastics-degrading microbes from mangrove soil. International Journal of Tropical Biology and Conservation, 51. 629-634.

[28] Anoniem. (2013). Marine Agar 2216 & Marine Broth. Difco™ & BBL™ Manual, 2nd Edition, 2.

[29] Anoniem. Maximum Recovery Diluent [www], 2013, Oxoid.

URL:http://www.oxoid.com/UK/BLUE/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0733&c=UK…

Gezien d.d. 20 april 2013

[30] Anoniem. Ringer Solution [www], 2013, Oxoid.

URL:http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=BR0052&c=UK…

Gezien d.d. 20 april 2013

[31] Anoniem. 00464 Plate Count Agar plates [www], 2013, Sigma Aldrich

URL:http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Fluka/Datasheet/00464dat…

Gezien d.d. 20 april 2013

[32] Demeyere, M. (2011-2012). Cursus DNA en RNA technieken. Module Biotechnologie - Biomedische Laboratoriumtechnieken. 55-59.

[33] Anoniem. V3-V5 region of 16S rDNA gene of all bacteria… [www], 2009, Bric.

URL: http://bric.postech.ac.kr/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=75437

Gezien d.d. 22 april 2013

[34] Muyzer, G. et al. (1992). Profiling of Complex Mirobial Populations by Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis Analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, 3, 695-700.

[35] Chakravorty, S. et al. (2007). A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. NIH Public Access, 69, 330-339.

[36] Anoniem. (2006). Pretreatment for Gram-Positive Bacteria. DNeasy® Blood & Tissue Handbook, 30-45.

[37] Hecker, K. Roux, K. (1996). High and Low Annealing temperatures Increase Both Specificity and Yield in Touchdown and Stepdown PCR. Biotechniques, 20, 478-485.

[38] Zumbo, P. Ethanolprecipitation [www]. Weill Cornell medical college. URL:http://physiology.med.cornell.edu/faculty/mason/lab/zumbo/files/ETHANOL…

Gezien d.d. 28 april 2013

 

 [39] Yu, Z. Morrison, M. (2004). Comparisons of Different Hypervariable Regions of rrs Genes for Use in Fingerprinting of Microbial Communities by PCR-Denaturing Gradient Gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology, 8, 4800-4806.

[40] Madigan, M. Martinko, J. Stahl, D. Clark, D. (2012). Brock biology of microorganisms. Library of Congress Catalogus-in-Publication Data, 13, 486-2635.

[41]Anoniem. Sonicatie [www]. Waterdesinfectie met zonlicht. URL: http://telescript.denayer.wenk.be/2008-09/c3/public_html/ultrasonicatie…

Gezien d.d. 1 mei 2013

[42] Kinoshita et al. (1975). Utilization of a Cyclic Dimer and Linear Oligomers of ε-Aminocaproic Acid by Achrobacter guttatus KI 72. Agr. Biol. Chem, 6, 1219-1223.

[43] Kathiresan, K. (2003). Polythene and Plastics-degrading microbes from the mangrove soil. Rev. Biol. Trop, 3, 629-634.

[44] Balasubramanian et al. (2010). High-density polyethylene (HDPE)-degrading potential bacteria from marine ecosystem of Gulf of Mannar, India. Letters in Applied Microbiology, 51, 205-211.

[45] Pramila et al. (2012). Brevibacillus parabrevis, Acinetobacter baumanii and Pseudomonas citronellolis - Potential candidates for biodegradation of low density polyethylene (LDPE). Journal of Bacteriology Ressearch, 4, 9-14.

[46] Harrison P, J. (2012). The spectroscopic detection and bacterial colonization of synthetic microplastics in coastal marine sediments. Department of Animal and Plant Sciences- The University of Sheffield.

 

 

 

Universiteit of Hogeschool
Farmaceutische en Biologische Laboratoriumtechnologieën
Publicatiejaar
2013
Promotor(en)
Ellen Decat
Kernwoorden
Share this on: