Intracellulaire transductiewegen en expressiepatronen van short en long neuropeptide F signaalsystemen bij Glossina morsitans

Katleen

Peymen

Jelle

Caers
Liliane

Schoofs

Neuropeptide F en short neuropeptide F signaalsystemen als nieuwe en milieuvriendelijke insecticide-doelwitten bij tseetseevliegen.

Tseetseevliegen (Fig. 1) hebben een groot medisch en economisch belang als overdragers van parasieten die ziekten veroorzaken bij zowel de mens (slaapziekte) als bij dieren (nagana). Deze ziekten worden dan ook vooral onder controle gehouden door het bestrijden van tseetseevliegen. Verschillende bestrijdingsmiddelen bestaan, maar houden voornamelijk schadelijke en milieuvervuilende chemische insecticiden in. Huidig onderzoek focust zich daarom op het zoeken van doelwitten voor de ontwikkeling van nieuwe insect-specifieke en niet-toxisch insecticiden. Neuropeptiden zijn interessante doelwitten voor dergelijke insecticiden, aangezien deze signaalmoleculen nagenoeg al de lichamelijke en gedragsprocessen reguleren tijdens de ontwikkeling en reproductie. Twee dergelijke neuropeptide-systemen werden in deze thesis onderzocht.

Tseetseevliegen als overbrengers van humane en dierlijke Afrikaanse trypanosomiase

Tseetseevliegen fungeren als overbrengers van trypanosomen, eencellige parasieten die tot het geslacht Trypanosoma behoren. Bij mensen veroorzaken deze parasieten humane Afrikaanse trypanosomiase, beter bekend als slaapziekte. Bij dieren veroorzaken ze dierlijke Afrikaanse trypanosomiase. Deze ziekten beperken zich tot sub-Saharisch Afrika, het leefgebied is van de tseetseevliegen (Fig. 2). Slaapziekte vormt hier dan ook een bedreiging voor miljoenen mensen. In een eerste stadium wordt slaapziekte gekenmerkt door o.a. koorts, hoofdpijn, jeuk en gezwollen lymfeklieren. In een tweede stadium worden slaap- en psychische stoornissen veroorzaakt. Zonder behandeling volgt onvermijdelijk de dood. De huidige behandelingsmethoden voor slaapziekte zijn echter sterk verouderd en veroorzaken toxische bijwerkingen die letaal kunnen zijn.

Dierlijke Afrikaanse trypanosomiase staat in de volksmond beter gekend als nagana, wat in het Zoeloes “depressief zijn” betekent. Nagana draagt sterk bij tot de armoede in landelijk Afrika, voornamelijk doordat zieke koeien weinig vlees en melk produceren. Er werd dan ook geschat dat de kost van nagana 4,5 miljard dollar bedraagt.

Ondanks verschillende inspanningen om slaapziekte en nagana onder controle te houden, zoals screening en preventieve behandeling, zal een volledige controle van deze ziekten afhangen van het vermijden van contact tussen tseetseevliegen en mensen en dieren. Daarom worden reeds verschillende methoden gebruikt voor het bestrijden van tseetseevliegen, waarbij de voornaamste manier tot op heden het gebruik van schadelijke chemische insecticiden is. Een ongecontroleerde toepassing van deze insecticiden heeft geleid tot vervuiling van de omgeving met toxische producten, schadelijk voor zowel mensen en andere organismen, met als gevolg een verstoring van de ecologische balans. Wereldwijd onderzoek focust zich daarom op de zoektocht naar doelwitten en componenten die kunnen dienen voor de ontwikkeling van nieuwe generaties van niet-toxische en insect-specifieke bestrijdingsmiddelen ter vervanging van de schadelijke chemicaliën.

Neuropeptiden als mogelijke doelwitten voor insecticiden

Insect neuropeptiden en hun receptoren vormen een belangrijk doelwit voor de ontwikkeling van dergelijke nieuwe insecticiden aangezien deze moleculen nagenoeg al de lichamelijke en gedragsprocessen reguleren tijdens de ontwikkeling en reproductie. Neuropeptiden worden namelijk door zenuwcellen gebruikt om met elkaar te communiceren. Een neuropeptide reist van één zenuwcel naar een andere zenuwcel, waar het zal binden aan een receptor. Deze receptor is een eiwit dat zich bevindt in de membraan van de zenuwcel. Bij binding aan het neuropeptide zal de receptor een signaalcascade in gang zal zetten om een boodschap door te geven aan het binnenste van de cel. Dit zal resulteren in een bepaalde reactie van deze cel. Indien men de normale werking van deze neuropeptide signaalsystemen kan verhinderen of extra stimuleren, kan dit leiden tot nefaste effecten op de groei, ontwikkeling en het gedrag van insecten. Op deze manier kunnen deze componenten bijgevolg fungeren als insecticiden.

Neuropeptide F (NPF) en short neuropeptide F (sNPF)

In deze thesis werden twee mogelijke neuropeptide-systemen nader bestudeerd om na te gaan of deze systemen mogelijke doelwitten kunnen zijn voor de ontwikkeling van insecticiden voor tseetseevliegen. Deze twee signaalsystemen waren het neuropeptide F (NPF)- en short neuropeptide F (sNPF)-signaalsysteem. Twee doelstellingen werden aan het begin van deze thesis vooropgesteld. In een eerste stap wilden we bepalen welk signaalmolecule deze neuropeptiden gebruiken om te communiceren met het binnenste van de cel. Vervolgens wilden we weten waar deze neuropeptiden en hun receptoren tot expressie komen in de tseetseevlieg. De plaats waar deze neuropeptiden tot expressie komen geeft ons namelijk meer inzicht in bij welke processen deze neuropeptiden betrokken zijn en of ze bijgevolg goede doelwitten kunnen vormen.

Een mogelijke signaalweg die we onderzocht hebben verloopt via het signaalmolecule calcium. Wanneer de signaalweg via calcium verloopt, wordt calcium geproduceerd wanneer het neuropeptide bindt aan de receptor. Deze calcium kan gevisualiseerd worden door toevoeging van een bepaald molecule aan de cellen, dat een fluorescent signaal vrijgeeft wanneer het kan binden aan calcium. Dit fluorescent signaal kan bijgevolg gemeten worden. Via deze experimenten konden we aantonen dat de signaalweg voor beide systemen inderdaad via calcium verloopt.

In een tweede stap zijn we nagegaan in welke weefsels en ontwikkelingsstadia de neuropeptiden en hun receptoren tot expressie komen. Proteïnen worden namelijk gecodeerd door genen, bestaande uit DNA. Dit DNA wordt in bepaalde weefsels gekopieerd in de vorm van RNA, en dit RNA wordt gebruikt om proteïnen samen te stellen. Dit RNA wordt echter niet per sé in alle cellen/weefsels aangemaakt, maar kan ook in slechts een bepaalde selectie worden afgeschreven. Door de expressie van het RNA na te gaan, kunnen we bijgevolg een indicatie krijgen van waar de neuropeptiden tot expressie komen. We vonden dat de NPF en sNPF peptiden tot expressie komen in het centrale zenuwstelsel, cellen in de darm en in de buisjes van Malpighi, het equivalent van nieren bij insecten. Deze expressiepatronen stemmen overeen met de expressie van NPF en sNPF bij andere insecten, waar deze peptiden een rol spelen bij voeding en vertering.

NPF en sNPF blijken inderdaad mogelijke doelwitten te zijn voor de ontwikkeling van nieuwe insecticiden, aangezien deze peptiden mogelijks een rol spelen bij voeding en vertering. Verdere experimenten zijn echter nodig om na te gaan of dit inderdaad het geval is. De peptiden kunnen geïnjecteerd worden in tseetseevliegen, of de peptiden of receptoren kunnen uitgeschakeld worden, waarna het effect op voedingsgedrag bekeken kan worden. Wanneer deze neuropeptiden inderdaad bij voeding en vertering betrokken zijn, maakt dit van hen interessante systemen om te verstoren en hierdoor een insecticide te maken.

Bibliografie

Aksoy, S. (2003). "Control of tsetse flies and trypanosomes using molecular genetics." Veterinary Parasitology 115(2): 125-145.

Aksoy, S. (2011). "Sleeping sickness elimination in sight: time to celebrate and reflect, but not relax." PLoS Neglected Tropical Disease 5(2): e1008.

Altstein, M. (2004). "Novel insect control agents based on neuropeptide antagonists." Journal of Molecular Neuroscience 22(1-2): 147-157.

Altstein, M. and Nässel, D. (2010). Neuropeptide signaling in insects. Neuropeptide Systems as Targets for Parasite and Pest Control. T. Geary and A. Maule, Springer US. 692: 155-165.

Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T. and Verleyen, P. (2011). Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay. Neuropeptides. A. Merighi, Humana Press. 789: 377-391.

Benfey, P. N. and Protopapas, A. D. (2005).Essentials of genomics. Prentice-Hall.

Brown, M. R., Crim, J. W., Arata, R. C., Cai, H. N., Chun, C. and Shen, P. (1999). "Identification of a Drosophila brain-gut peptide related to the neuropeptide Y family." Peptides 20(9): 1035-1042.

Brun, R., Blum, J., Chappuis, F. and Burri, C. (2009). "Human African trypanosomiasis." Lancet 375(9709): 148-159.

Bursell, E. (1977). "Synthesis of proline by fat body of the tsetse fly (Glossina morsitans): metabolic pathways." Insect Biochemistry 7: 427-434.

Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K. and Schoofs, L. (2012). "More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: an overview." Frontiers in Endocrinology 3.

Centers for Disease Control and Prevention (2012, August 29). Verkregen op 5 december, 2012, van: http://www.cdc.gov/parasites/sleepingsickness/biology.html.

Clark, W. and Christopher, K. (2000). An introduction to DNA: Apectrophotometry, degradation, and the “Frankengel’ experiment. Tested studies for laboratory teaching.

Dierick, H. A. and Greenspan, R. J. (2007). "Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression." Nature Genetics 39(5): 678-682.

Dillen, S., Zels, S., Verlinden, H., Spit, J., Van Wielendaele, P. and Vanden Broeck, J. (2013). "Functional characterization of the short neuropeptide F receptor in the desert locust, Schistocerca gregaria." PLoS ONE 8(1): e53604.

Erlich, H. (1989). "Polymerase chain reaction." Journal of Clinical Immunology 9(6): 437-447.

Feldmann, U., Dyck, V. A., Mattioli, R. C. and Jannin, J. (2005). Potential impact of tsetse fly control involving the sterile insect technique. Sterile Insect Technique. V. A. Dyck, J. Hendrichs and A. S. Robinson, Springer Netherlands: 701-723.

FlyAtlas (2013, May 7) Verkregen op 10 mei, 2013, van: http://www.flybase.org

Fraga, D., Meulia, T. and Fenster, S. (2008). Real-time PCR. Current Protocols Essential Laboratory Techniques, John Wiley & Sons, Inc.

Garczynski, S. F., Brown, M. R. and Crim, J. W. (2006). "Structural studies of Drosophila short neuropeptide F: occurrence and receptor binding activity." Peptides 27(3): 575-582.

Garczynski, S. F., Brown, M. R., Shen, P., Murray, T. F. and Crim, J. W. (2002). "Characterization of a functional neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster." Peptides 23(4): 773-780.

Garczynski, S. F., Crim, J. W. and Brown, M. R. (2005). "Characterization of neuropeptide F and its receptor from the African malaria mosquito, Anopheles gambiae." Peptides 26(1): 99-107.

Garczynski, S. F., Crim, J. W. and Brown, M. R. (2007). "Characterization and expression of the short neuropeptide F receptor in the African malaria mosquito, Anopheles gambiae." Peptides 28(1): 109-118.

Gonzalez, R. and Orchard, I. (2008). "Characterization of neuropeptide F-like immunoreactivity in the blood-feeding hemipteran, Rhodnius prolixus." Peptides 29(4): 545-558.

Gonzalez, R. and Orchard, I. (2009). "Physiological activity of neuropeptide F on the hindgut of the blood-feeding hemipteran, Rhodnius prolixus." Journal of insect science (Online) 9: 1-14.

Hancock, J. T. (2005).Cell signalling , New York: Oxford University Press.

Hangrove, J. W. (1975). "Amino acid metabolism during flight in tsetse flies." Journal of Insect Physiology 22(2): 309-313.

Herzog, H., Hort, Y. J., Ball, H. J., Hayes, G., Shine, J. and Selbie, L. A. (1992). "Cloned human neuropeptide Y receptor couples to two different second messenger systems." Proceedings of the National Academy of Sciences 89(13): 5794-5798.

Holmgren, S. and Jensen, J. (2001). "Evolution of vertebrate neuropeptides." Brain Research Bulletin 55(6): 723-735.

Huang, Y., Crim, J. W., Nuss, A. B. and Brown, M. R. (2011). "Neuropeptide F and the corn earworm, Helicoverpa zea: A midgut peptide revisited." Peptides 32(3): 483-492.

Hunt, R. (2009). "Molecular parasitology: trypanosomes." Verkregen op 29 november, 2012, via University of South Carolina School of medicine, microbiology and immunology on-line website: http://pathmicro.med.sc.edu/book/parasit-sta.htm.

Inouye, S. and Tsuji, F. I. (1992). "Monitoring gene expression in Chinese hamster ovary cells using secreted apoaequorin." Analytical Biochemistry 201(1): 114-118.

Janssen, T., Beets I and Schoofs, L (2011). Deorphaning C. elegans peptide GPCRs. The Worm Breeder’s Gazette 18.

Johard, H. A. D., Yoishii, T., Dircksen, H., Cusumano, P., Rouyer, F., Helfrich-Förster, C. and Nässel, D. R. (2009). "Peptidergic clock neurons in Drosophila: Ion transport peptide and short neuropeptide F in subsets of dorsal and ventral lateral neurons." The Journal of Comparative Neurology 516(1): 59-73.

Kabayo, J. P. (2002). "Aiming to eliminate tsetse from Africa." Trends in Parasitology 18(11): 473-475.

Kahsai, L., N. Kapan, H. Dircksen, Å. M. E. Winther and D. R. Nässel (2010a). "Metabolic stress responses in Drosophila are modulated by brain neurosecretory cells that produce multiple neuropeptides." PLoS ONE 5(7): e11480.

Kahsai, L., Martin, J.-R. and Winther, Å. M. E. (2010b). "Neuropeptides in the Drosophila central complex in modulation of locomotor behavior." The Journal of Experimental Biology 213(13): 2256-2265.

Kennedy, P. G. E. (2008). "The continuing problem of human African trypanosomiasis (sleeping sickness)." Annals of Neurology 64(2): 116-126.

Kettle, D. S. (1995). Medical and veterinary entomology (Vol. 725). Wallingford: CAB international.

Kulathila, R., A. Merkler, K. and J. Merkler, D. (1999). "Enzymatic formation of C-terminal amides." Natural Product Reports 16(2): 145-154.

Krafsur, E. S. (2009). "Tsetse flies: genetics, evolution, and role as vectors." Infection, Genetics and Evolution 9(1): 124-141.

Krashes, M. J., DasGupta, S., Vreede, A., White, B., Armstrong, J. D. and Waddell, S. (2009). "A neural circuit mechanism integrating motivational state with memory expression in Drosophila." Cell 139(2): 416-427.

Larhammar, D. A. N., Söderberg, C. and Lundell, I. (1998). "Evolution of the neuropeptide Y family and its receptors." Annals of the New York Academy of Sciences 839(1): 35-40.

Leak, S. G. (1999). Tsetse Biology and Ecology: Their Role in the Epidemiology and Control of Trypanosmosis, CABI publishing.

Lee, G., Bahn, J. H. and Park, J. H. (2006). "Sex- and clock-controlled expression of the neuropeptide F gene in Drosophila." Proceedings of the National Academy of Sciences 103(33): 12580-12585.

Lee, K.-S., You, K.-H., Choo, J.-K., Han, Y.-M. and Yu, K. (2004). "Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size." Journal of Biological Chemistry 279(49): 50781-50789.

Lingo, P. R., Zhao, Z. and Shen, P. (2007). "Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster." Neuroscience 148(2): 371-374.

Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method." Methods 25(4): 402-408.

Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C. A., Krieger, M., Bretscher, A., Ploegh, H., Amon, A. and Scott, M. P. (2012). Molecular Cell Biology. WH Freeman & Company

Malvy, D. and Chappuis, F. (2011). "Sleeping sickness." Clinical Microbiology and Infection 17(7): 986-995.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J.(1982). Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory.

McCord, P. F., Messina, J. P., Campbell, D. J. and Grady, S. C. (2012). "Tsetse fly control in Kenya’s spatially and temporally dynamic control reservoirs: A cost analysis." Applied Geography 34(0): 189-204.

Merkler, D. J. (1994). "C-terminal amidated peptides: Production by the in vitro enzymatic amidation of glycine-extended peptides and the importance of the amide to bioactivity." Enzyme and Microbial Technology 16(6): 450-456.

Mertens, I., T. Meeusen, R. Huybrechts, A. De Loof and Schoofs, L. (2002). "Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster." Biochemical and Biophysical Research Communications 297(5): 1140-1148.

Nässel, D. R. (2002). "Neuropeptides in the nervous system of Drosophila and other insects: multiple roles as neuromodulators and neurohormones." Progress in neurobiology 68(1): 1-84.

Nässel, D. R. and Wegener, C. (2011). "A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates: Any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling?" Peptides 32(6): 1335-1355.

Nässel, D. R., Enell, L. E., Santos, J. G., Wegener, C. and Johard, H. A. D. (2008). "A large population of diverse neurons in the Drosophila central nervous system expresses short neuropeptide F, suggesting multiple distributed peptide functions." BMC Neuroscience 9(1): 90.

Nimmo, C. (2010). "Time to put out the lights on sleeping sickness?" Travel Medicine and Infectious Disease 8(4): 263-268.

Oluwafemi, R. (2009): "The impact of African animal trypanosomosis and tsetse fly on the livelihood and well-being of cattle and their owners in the BICOT study area of Nigeria." The Internet Journal of Veterinary Medicine 5(2). DOI: 10.5580/2397.

Onken, H., Moffett, S. B. and Moffett, D. F. (2004). "The anterior stomach of larval mosquitoes (Aedes aegypti): effects of neuropeptides on transepithelial ion transport and muscular motility." Journal of Experimental Biology 207(21): 3731-3739.

Pedrazzini, T., Pralong, F. and Grouzmann, E. (2003). "Neuropeptide Y: the universal soldier." Cellular and Molecular Life Sciences 60(2): 350-377.

Schoofs, L., Danger, J. M., Jegou, S., Pelletier, G., Huybrechts, R., Vaudry, H. and De Loof, A. (1988). "NPY-like peptides occur in the nervous system and midgut of the migratory locust, Locusta migratoria and in the brain of the grey fleshfly, Sarcophaga bullata." Peptides 9(5): 1027-1036.

Shen, P. and Cai, H. N. (2001). "Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food." Journal of Neurobiology 47(1): 16-25.

Shuman, S. (1994). "Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using Vaccinia DNA topoisomerase." Journal of Biological Chemistry 269(51): 32678-32684.

Simarro, P. P., Cecchi, G., Franco, J. R., Paone, M., Diarra, A., Ruiz-Postigo, J. A., Fèvre, E. M., Mattioli, R. C. and Jannin, J. G. (2012). "Estimating and mapping the population at risk of sleeping sickness." PLoS Neglected Tropical Disease 6(10): e1859.

Simarro, P. P., Jannin, J. and Cattand, P. (2008). "Eliminating Human African Trypanosomiasis: Where Do We Stand and What Comes Next?" PLoS Medicine 5(2): e55.

Stanek, D. M., Pohl, J., Crim, J. W. and Brown, M. R. (2002). "Neuropeptide F and its expression in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti." Peptides 23(8): 1367-1378.

Taylor, K. and Authié, E. M.-L. (2004). "Pathogenesis of animal trypanosomiasis." In Maudlin, I., Holmes, P. H., & Miles, M. A. (eds).The trypanosomiases (pp. 331-359). CAB international.

Uilenberg, G. (1998). A field guide for the diagnosis, treatment and prevention of African animal trypanosomosis. Food & Agriculture Org.

Vandesompele, J., De Preter, K., Pattyn, F., Poppe, B., Van Roy, N., De Paepe, A. and Speleman, F. (2002). "Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes." Genome Biology 3(7): RESEARCH0034.

Van Hiel, M., Van Loy, T., Poels, J., Vandersmissen, H., Verlinden, H., Badisco, L. and Broeck, J. (2010). "Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents. " Neuropeptide Systems as Targets for Parasite and Pest Control. T. Geary and A. Maule, Springer US. 692: 211-226.

Van Wielendaele, P., Wynant, N., Dillen, S., Badisco, L., Marchal, E. and Vanden Broeck, J. (2013a). "In vivo effect of Neuropeptide F on ecdysteroidogenesis in adult female desert locusts (Schistocerca gregaria)." Journal of Insect Physiology 59(6): 624-630.

Van Wielendaele, P., Wynant, N., Dillen, S., Zels, S., Badisco, L. and Vanden Broeck, J. (2013b). "Neuropeptide F regulates male reproductive processes in the desert locust, Schistocerca gregaria." Insect Biochemistry and Molecular Biology 43(3): 252-259.

Vincendeau, P., Gobert, A. P., Daulouède, S., Moynet, D. and Djavad Mossalayi, M. (2003). "Arginases in parasitic diseases." Trends in Parasitology 19(1): 9-12.

Vreysen, M. J. B., Saleh, K. M., Ali, M. Y., Abdulla, A. M., Zhu, Z.-R., Juma, K. G., Dyck, V. A., Msangi, A. R., Mkonyi, P. A. and Feldmann, H. U. (2000). "Glossina austeni (Diptera: Glossinidae) eradicated on the island of Unguja, Zanzibar, using the sterile insect technique." Journal of Economic Entomology 93(1): 123-135.

Vreysen, M. J. B., Seck, M. T., Sall, B. and Bouyer, J. (2013). "Tsetse flies: Their biology and control using area-wide integrated pest management approaches." Journal of Invertebrate Pathology 112, Supplement 1(0): S15-S25.

Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q. and Shen, P. (2005). "Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102(6): 2141-2146.

Wu, Q., Wen, T., Lee, G., Park, J. H., Cai, H. N. and Shen, P. (2003). "Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system." Neuron 39(1): 147-161.

WHO (2006). "Human African trypanosomiasis (sleeping sickness): epidemiological update." The weekly epidemiological record 81(8): 71-80.

WHO. (2012, october 2012). "Trypanosomiasis, human African (sleeping sickness)." Verkregen op 7 februari, 2013, van http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs259/en/.

Xu, J., M. Li and P. Shen (2010). "A G-protein-coupled neuropeptide Y-like receptor suppresses behavioral and sensory response to multiple stressful stimuli in Drosophila." The Journal of Neuroscience 30(7): 2504-2512.