“Investigating the Zinc Homeostasis Network in Suillus luteus: Zinc Transporters”

Laura
Coninx

De ondergrondse redder van dennenbomen in Noord-Limburg

Vele zandgronden in het Noorden van Limburg zijn zwaar vervuild met zink, cadmium en lood door de jarenlange metaalverwerkende industrie in deze regio. Ondanks het feit dat de meeste van deze zinkfabrieken gesloten zijn of een betere milieukwaliteitszorg hebben aangewend, blijft de vervuiling een belangrijk probleem. Niet alleen wordt de plaatselijke fauna en flora door deze vervuiling aangetast, ook de menselijke gezondheid loopt gevaar. Studies hebben namelijk reeds kunnen aantonen dat er een verhoogde kankerincidentie in deze regio is.

Omdat deze regio vooral gekenmerkt wordt door zanderige bodems, kan de vervuiling gemakkelijk door de wind worden verspreid. Een mogelijke “groene” oplossing voor dit probleem is fytostabilisatie. Deze duurzame techniek gebruikt planten om de vervuiling vast te leggen en om een verdere verspreiding te voorkomen. Erosie door water en wind zal immers verhinderd worden door een gesloten vegetatiedek en uitgebreid wortelsysteem. Echter een belangrijk probleem bij het toepassen van deze techniek is erin slagen om planten ook effectief te laten groeien en overleven op deze vervuilde sites. In Noord-Limburg zijn de metaalconcentraties in de bodem immers zo hoog dat ze toxisch zijn voor de meeste planten. Een plant die echter geen hinder van deze vervuiling lijkt te ondervinden is Pinus sylvestris, de grove den. Deze soort wordt vaak teruggevonden op vervuilde sites en onderzoekers vroegen zich natuurlijk af hoe dit kwam.

Onderzoek van de Universiteit Hasselt toonde aan dat de dennen op hun eigen niet in staat zijn om te overleven op de vervuilde sites. Zij danken hun overleving aan de samenwerking met de mycorrhizaschimmel Suillus luteus, beter gekend als de bruine ringboleet. Suillus luteus leeft – net als andere mycorrhizaschimmels – in symbiose met planten samen. De plant en de schimmel gaan samen dit partnerschap aan omdat ze hier beiden voordeel uit halen. De plant voorziet de schimmel van suikers en krijgt in ruil hiervoor nutriënten van de schimmel. Van sommige mycorrhizaschimmels is tevens geweten dat zij hun gastheerplant tegen pathogenen beschermen. Onze schimmel, Suillus luteus, is echter nog een stapje verder gegaan. Bepaalde individuen van deze soort kunnen hun gastheerplant zelfs van zinkvervuiling vrijwaren. Dit doen ze door terug te vallen op een efficiënt zink exclusiemechanisme dat waarschijnlijk het gevolg is van een bepaalde mutatie in een gen van Suillus luteus. Hierbij wordt het overgrote deel van zink dat in de cellen terechtkomt terug naar buiten gewerkt.

Het gebruik van deze zinktolerante Suillus luteus isolaten kan dus bijgevolg bijdragen aan een succesvolle fytostabilisatie van zinkvervuilde gebieden in Noord-Limburg. Maar om deze toepassing zo efficiënt mogelijk uit te voeren is het belangrijk om het tolerantiemechanisme eerst voldoende te begrijpen. Het was dit tolerantiemechanisme dat ik in mijn masterthesis heb onderzocht door eerst de algemene zinkhuishouding van Suillus luteus op niveau van de cel in kaart te brengen. Bepaalde families van zinktransporter proteïnen werden in kaart gebracht en de activiteit van hun genen werd geëvalueerd. Er werden een aantal interessante genen ontdekt die een verschillende activiteit hadden tussen zink- tolerante en sensitieve Suillus luteus stammen. Dit verschil in genactiviteit wijst erop dat deze genen betrokken kunnen zijn bij de zinktolerantie. Verder onderzoek is echter nodig om dit uit te wijzen, want het verschil in genactiviteit kan natuurlijk ook een gevolg zijn van het tolerantiemechanisme i.p.v. de oorzaak. Het gen verantwoordelijk voor het tolerantie mechanisme kan immers de activiteit van andere genen beïnvloeden. Deze genen kunnen hierdoor een verschillende activiteit hebben in tolerante en sensitieve schimmels, maar niet rechtstreeks betrokken zijn bij het tolerantiemechanisme.

Naast het zinktolerantiemechanisme en de fytostabilisatietoepassing is het ook interessant om Suillus luteus als soort te bestuderen. Deze schimmel is immers een typische pionierssoort die als eerste nieuwe gebieden gaat koloniseren. En doordat deze soort in staat moet zijn om in een brede range van omgevingen te kunnen overleven is er een zeer grote genetische variabiliteit binnen de soort. Bij de kolonisatie van nieuwe gebieden worden dan de individuen met het gunstigste genenarsenaal door het milieu geselecteerd. Dit was ook zo in de zinkvervuilde gebieden. Op korte tijd ontwikkelden zich hier zinktolerante subpopulaties van Suillus luteus. Individuen werden geselecteerd op basis van hun zinktolerantie, want anders konden ze niet overleven. Vorig onderzoek toonde aan dat deze tolerantie waarschijnlijk het gevolg is van een mutatie in één gen. Hierdoor wordt het fenomeen van het ontwikkelen van zinktolerante subpopulaties beschouwd als een geval van micro-evolutie. Het prefix “micro” in deze term slaat terug op de korte tijdsspanne waarin deze ontwikkeling plaatsvond. De term evolutie kan dan weer worden toegepast omdat de nieuwe subpopulatie van zinktolerante schimmels genetisch verschillend is van de oorspronkelijke populatie.

In een dennenbos kan er dus veel meer aan de hand zijn dan op het eerste gezicht lijkt! Er zullen ongetwijfeld velen zijn die bij een wandeling in de natuur niet zullen stilstaan bij een eenzame paddenstoel, hoewel deze vaak een belangrijke rol speelt binnen het ecosysteem. De paddenstoel die wij zien maakt immers maar een klein deel van de mycorrhizaschimmel uit. Deze paddenstoel is eigenlijk een voortplantingslichaam van de schimmel, terwijl het echte schimmellichaam, het mycelium, zich ondergronds bevindt. Dit mycelium bestaat uit uitgebreide netwerken van schimmeldraden, die bij mycorrhizaschimmels onder meer instaan voor de bevoorrading van de plant met nutriënten of hem beschermen tegen schadelijke stoffen.

We kunnen dus concluderen dat het bestuderen van iets wat in eerste instantie misschien onbeduidend lijkt, soms toch belangrijk en nuttig kan zijn. Verder onderzoek is echter nodig vooraleer we Suillus luteus optimaal kunnen gebruiken voor de stabilisatie van vervuilde gebieden, maar de basis voor deze toepassing is wel al gelegd.

Laura Coninx
Universiteit Hasselt
Oktober 2013

Bibliografie

1. Leyval C, Turnau K & Haselwandter K. Effect of heavy metal pollution on mycorrhizal colonization and function: physiological, ecological and applied aspects. Mycorrhiza 7, 139–153 (1997).2. Adriaensen K, Vangronsveld J & Colpaert JV. Zinc-tolerant Suillus bovinus improves growth of Zn-exposed Pinus sylvestris seedlings. Mycorrhiza 16, 553–8 (2006).3. Colpaert JV, Adriaensen K, Muller LAH, Lambaerts M, Faes C, Carleer R & Vangronsveld J. Element profiles and growth in Zn-sensitive and Zn-resistant Suilloid fungi. Mycorrhiza 15, 628–34 (2005).4. Muller LAH, Vangronsveld J & Colpaert JV. Genetic structure of Suillus luteus populations in heavy metal polluted and nonpolluted habitats. Molecular ecology 16, 4728–37 (2007).5. Krznaric E, Wevers JHL, Cloquet C, Vangronsveld J, Vanhaecke F & Colpaert JV. Zn pollution counteracts Cd toxicity in metal-tolerant ectomycorrhizal fungi and their host plant, Pinus sylvestris. Environmental microbiology 12, 2133–41 (2010).6. Norrstrôm AC. Concentration and chemical species of iron in soils from groundwater / surface water ecotones. Hydrological Sciences Journal 40, 319- 29 (1995).7. Frausto da Silva JJR & Williams RJP. The biological chemistry of the elements (2nd edition). Clarendon Press (2001).8. Alloway BJ. Zinc in SoilS and Crop Nutrition. International Zinc Association 1, 1-137 (2008).9. Hart JJ, Welch RM & Norvell WA. Transport interactions between cadmium and zinc in roots of bread and durum wheat seedlings. Physiol Plant. 116, 73–78 (2002).10. Clemens S. Evolution and function of phytochelatin synthases. Journal of plant physiology 163, 319–32 (2006).11. Clemens S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants. Biochimie 88, 1707–19 (2006).12. Bellion M, Courbot M, Jacob C, Blaudez D & Chalot M. Extracellular and cellular mechanisms sustaining metal tolerance in ectomycorrhizal fungi. FEMS microbiology letters 254, 173–81 (2006).13. Petrucci RH, Herring FG, J. D. M. and C. B. General Chemistry: Principles and Modern Applications (9th edition) Prentice Hall (2010).14. Berg J & Shi Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science 271, 1081–1085 (1996).15. Schulte EE. Soil and Applied Zinc (A2528). Understanding plant nutrients A2528, 1–2 (2004).16. Baize D. Teneurs totales en elements traces metalligues dans les sols (France) INRA Editions, Paris. 1-409 (1997).17. Yadav SK. Heavy metals toxicity in plants: An overview on the role of glutathione and phytochelatins in heavy metal stress tolerance of plants. South African Journal of Botany 76, 167–179 (2010).18. Clemens S. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta 212, 475-486 (2001).19. Li S, Yu J, Zhu M, Zhao F & Luan S. Cadmium impairs ion homeostasis by altering K+ and Ca2+ channel activities in rice root hair cells. Plant, cell & environment 35, 1998–2013 (2012).20. Abbà S. A PLAC8-containing protein from an endomycorrhizal fungus confers cadmium resistance to yeast cells by interacting with Mlh3p. Nucleic acids research 39, 7548–63 (2011).21. Kenderesová L, Stanova A, Pavlovkin J, Durisova E, Nadubinska M, Ciamporova M & Ovecka M. Early Zn2+-induced effects on membrane potential account for primary heavy metal susceptibility in tolerant and sensitive Arabidopsis species. Annals of botany 110, 445–59 (2012).22. Hall JL. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. Journal of experimental botany 53, 1–11 (2002).23. Blaudez D. Differential responses of ectomycorrhizal fungi to heavy metals in vitro. 104, 1366–1371 (2000).24. Bearoff FM & Fuller-espie SL. Alteration of mitochondrial membrane potential ( Δ Ψm ) and phosphatidylserine translocation as early indicators of heavy metal-induced apoptosis in the earthworm Eisenia hortensis. ISJ 8, 98–108 (2011).25. Beyersmann D & Hartwig A. Carcinogenic metal compounds: recent insight into molecular and cellular mechanisms. Archives of Toxicology 82, 493–512 (2008).26. Jin YH, Clark AB, Slebos RJ, Al-Refai H, Taylor JA, Kunkel TA & Resnick M. Cadmium is a mutagen that acts by inhibiting mismatch repair. Nature Genetics 34, 326–329 (2003).27. Colpaert JV, Muller LAH, Lambaerts M, Adriaensen K & Vangronsveld J. Evolutionary adaptation to Zn toxicity in populations of Suilloid fungi. New Phytologist 162, 549–559 (2004).28. Lan H, Wang Z, Wang Q, Wang M, Bao Y, Huang J & Zhang H. Characterization of a vacuolar zinc transporter OZT1 in rice (Oryza sativa L.). Molecular biology reports 40, 1201–10 (2013).29. Haydon MJ & Cobbett CS. A novel major facilitator superfamily protein at the tonoplast influences zinc tolerance and accumulation in Arabidopsis. Plant physiology 143, 1705–19 (2007).30. Colpaert JV, Wevers J, Krznaric E & Adriaensen K. How metal-tolerant ecotypes of ectomycorrhizal fungi protect plants from heavy metal pollution. Annals of Forest Science 68, 17–24 (2011).31. Schat H, Llugany M & Bernhard R. Metal-specific patterns of tolerance, uptake and transport of heavy metals in hyperaccumulating and non-hyperaccumulating metallophytes. Phytoremediation of Contaminated Soil and Water 1, 171–188 (2000).32. Verbruggen N, Hermans C & Schat H. Molecular mechanisms of metal hyperaccumulation in plants. New Phytol 181, 759–776 (2009).33. Sinclair SA & Krämer U. The zinc homeostasis network of land plants. Biochimica et biophysica acta 1823, 1553–67 (2012).34. Sekler I, Sensi SL, Hershfinkel M & Silverman WF. Mechanism and Regulation of Cellular Zinc Transport. Mol Med 3, 1–6 (2007).35. Oteiza PI. Zinc and the modulation of redox homeostasis. Free radical biology & med 53, 1748–59 (2012).36. Lichten LA & Cousins RJ. Mammalian zinc transporters: nutritional and physiologic regulation. Annual review of nutrition 29, 153–76 (2009).37. Eide DJ. Zinc transporters and the cellular trafficking of zinc. Biochimica et biophysica acta 1763, 711–22 (2006).38. Nies DH & Silver S. Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. Journal of industrial microbiology 14, 186–99 (1995).39. Gustin JL, Zanis MJ & Salt DE. Structure and evolution of the plant cation diffusion facilitator family of ion transporters. BMC evolutionary biology 11, 76-86 (2011).40. Montanini B, Blaudez D, Jeandroz S, Sanders D & Chalot M. Phylogenetic and functional analysis of the Cation Diffusion Facilitator (CDF) family: improved signature and prediction of substrate specificity. BMC genomics 8, 107 (2007).41. Kambe T, Suzuki T, Nagao M & Yamaguchi-Iwai Y. Sequence similarity and functional relationship among eukaryotic ZIP and CDF transporters. Genomics, proteomics & bioinformatics 4, 1–9 (2006).42. Delhaize E, Kataoka T, Hebb DM, White RG & Ryan PR. Genes Encoding Proteins of the Cation Diffusion Facilitator Family That Confer Manganese Tolerance. The Plant Cell 15, 1131–1142 (2003).43. Blaudez D & Chalot M. Characterization of the ER-located zinc transporter ZnT1 and identification of a vesicular zinc storage compartment in Hebeloma cylindrosporum. Fungal genetics and biology 48, 496–503 (2011).44. Grotz N. Identification of a family of zinc transporter genes from Arabidopsis that respond to zinc deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 7220–4 (1998).45. Eng BH, Guerinot ML, Eide MHS. Membrane Biology Sequence Analyses and Phylogenetic Characterization of the ZIP Family of Metal Ion. J. Membrane Biol. 166, 1–7 (1998).46. Yang X, Huang J, Jiang Y & Zhang HS. Cloning and functional identification of two members of the ZIP (Zrt, Irt-like protein) gene family in rice (Oryza sativa L.). Molecular biology reports 36, 281–7 (2009).47. Guerinot ML. The ZIP family of metal transporters. Biochimica et biophysica acta 1465, 190–8 (2000).48. Chen SL, Wang ZJ, Xu MY & Gui JF. Molecular identification and expression analysis of natural resistance associated macrophage protein (Nramp) cDNA from Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Fish & shellfish immunology 20, 365–73 (2006).49. Cellier M, Prive G, Belouchi A, Kwan T, Rodrigues V, Chia W & Gros P. Nramp defines a family of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 10089–93 (1995).50. Pinner E, Gruenheid S, Raymond M & Gros P. Functional complementation of the yeast divalent cation transporter family SMF by NRAMP2, a member of the mammalian natural resistance-associated macrophage protein family. The Journal of biological chemistry 272, 28933–8 (1997).51. Nevo Y & Nelson N. The NRAMP family of metal-ion transporters. Biochimica et biophysica acta 1763, 609–20 (2006).52. Forbes JR & Gros P. Divalent-metal transport by NRAMP proteins at the interface of host-pathogen interactions. Trends in microbiology 9, 397–403 (2001).53. Techau ME, Valdez-Taubaz J, Popoff J, Francis R, Seaman M & Blackwell J. Evolution of differences in transport function in Slc11a family members. The Journal of biological chemistry 282, 35646–56 (2007).54. Haemig HAH & Brooker RJ. Importance of conserved acidic residues in mntH, the Nramp homolog of Escherichia coli. The Journal of membrane biology 201, 97–107 (2004).55. Muller LAH, Lambaerts M, Vangronsveld J & Colpaert JV. AFLP-based assessment of the effects of environmental heavy metal pollution on the genetic structure of pioneer populations of Suillus luteus. New Phytologist 164, 297–303 (2004).56. Peterson RL & Massicotte HB. Mycorrhizas : Anatomy and Cell Biology. NRC Research Press 1-182 (2004).57. Bruns TD, Tan J, Bidartando M & Szaro TM. Survival of Suillus pungens and Amanita francheti ectomycorrhizal genets was rare or absent after a stand-replacing fire. New Phytologist 155, 517–523 (2002).58. Adriaensen K, Van der Lelie D, Van Laere A, Vangronsveld J & Colpaert JV. A zinc-adapted fungus protects pines from zinc stress. New Phytologist 161, 549–555 (2004).59. Muller LAH, Craciun AR, Ruytinx J, Lambaerts M, Verbruggen N, Vangronsveld J & Colpaert JV. Gene expression profiling of a Zn-tolerant and a Zn-sensitive Suillus luteus isolate exposed to increased external zinc concentrations. Mycorrhiza 17, 571–80 (2007).60. Muller LAH, Lambaerts M, Vangronsveld J & Colpaert JV. Isolation and characterization of microsatellite loci from the ectomycorrhizal basidiomycete Suillus luteus. Molecular Ecology Notes 6, 165–166 (2006).61. Macnair MR. The genetic control of copper tolerance in the yellow monkey flower, Mimulus guttatus. Heredity 50, 283–293 (1983).62. Macnair MR. The genetics of metal tolerance in vascular plants. New Phytol 124, 541–559 (1993).63. Ruytinx J, Nguyen H, Van Hees M, Op De Beeck M, Vangronsveld J, Carleer R & Adriaensen K. Zinc export results in adaptive zinc tolerance in the ectomycorrhizal basidiomycete Suillus bovinus. Metallomics : integrated biometal science 1, 1-9 (2013).64. Krznaric E, Verbruggen N, Wevers JHL, Carleer R, Vangronsveld J & Colpaert JV. Cd-tolerant Suillus luteus: a fungal insurance for pines exposed to Cd. Environmental pollution 157, 1581–8 (2009).65. Saier MH, Tran CV & Barabote RD. TCDB: the Transporter Classification Database for membrane transport protein analyses and information. Nucleic acids research 34, D181–6 (2006).66. Ren Q, Chen K & Paulsen IT. TransportDB: a comprehensive database resource for cytoplasmic membrane transport systems and outer membrane channels. Nucleic acids research 35, D274–9 (2007).67. López-Millán AF, Ellis DR & Grusak M. a Identification and characterization of several new members of the ZIP family of metal ion transporters in Medicago truncatula. Plant molecular biology 54, 583–96 (2004).68. Rozen S & Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology 132, 365-387 (1994)69. Schmittgen TD & Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols 3, 1101–1108 (2008).70. Migeon A, Blaudez D, Wilkins O, Montanini B, Campbell MM, Richaud P, Thomine S & Chalot M. Genome-wide analysis of plant metal transporters, with an emphasis on poplar. Cellular and molecular life sciences : CMLS 67, 3763–84 (2010).71. Bird AJ. Metallosensors, the ups and downs of gene regulation. Advances in microbial physiology 53, 231–67 (2008).72. Lin SJ. Suppression of oxidative damage by Saccharomyces cerevisiae ATX2, which encodes a manganesetrafficking protein that localizes to Golgi-like vesicles. Mol Cell Biol 16, 6303–6312 (1996).73. Kuma´NA, Poruk KE, Osborn KA, Ward DM. YKE4 (YIL023C) encodes a bidirectional zinc transporter in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 281, 22566–22574 (2006).74. Vandesompele J, De Prete K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A & Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome biology 3, RESEARCH0034 (2002).75. Tjalsma H, Bolhuis A, Jongbloed JD, Bron S & Van Dijl JM. Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 64, 515–47 (2000).76. Von Heijne G. Signal Peptides. eLS 1, 1–3 (2005).77. Goswami T, Bhattacharjee A, Baball P, Searle S, Moore E Ming L & Blackwell JM. Natural resistance associated macrophage protein 1 is an H+/bivalent cation antiporter. Biochem J 519, 511–519 (2001).78. Ruytinx J, Craciun AR, Verstraelen K, Vangronsveld J, Colpaert JV & Verbruggen N. Transcriptome analysis by cDNA-AFLP of Suillus luteus Cd-tolerant and Cd-sensitive isolates. Mycorrhiza 21, 145–54 (2011).79. Lin YF & Aarts MGM. The molecular mechanism of zinc and cadmium stress response in plants. Cellular and molecular life sciences 69, 3187–206 (2012).80. Blaby-Haas CE & Merchant SS. The ins and outs of algal metal transport. Biochimica et biophysica acta 1823, 1531–52 (2012).81. Aisen P, Enns C & Wessling-Resnick M. Chemistry and biology of eukaryotic iron metabolism. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33, 940–959 (2001).82. Papanikolaou G & Pantopoulos K. Iron metabolism and toxicity. Toxicology and applied pharmacology 202, 199–211 (2005).83. Vig K. Bioavailability and toxicity of cadmium to microorganisms and their activities in soil: a review. Advances in Environmental Research 8, 121–135 (2003).84. Helmke PA. Chemistry of cadmium in soil solution. Cadmium in Soils and Plants. 1, 39–64 (1999).85. Lane T & Morel F. A biological function for cadmium in marine diatoms. Proc Natl Acad Sci USA 97, 4627–4631 (2000).86. Lane TW, Saito MA, George GN & Pickering IJ. Biochemistry: a cadmium enzyme from a marine diatom. Nature 435, 42 (2005).87. Odum HT. Heavy Metals in the Environment. Taylor & Francis Ltd, 1-344 (2000).

Download scriptie (2.74 MB)
Universiteit of Hogeschool
Universiteit Hasselt
Thesis jaar
2013