Metabolisatiestudie van methyldienolone en methyltrienolone aan de hand van het chimeer muismodel en humane lever microsomen

Otis Van Wayenberge
Dopinggerelateerde producten worden veelvuldig gebruikt in de sportwereld door hun prestatie bevorderend effect en bovendien worden er telkens ook nieuwe producten op de markt gebracht om zo de dopingcontroles te kunnen omzeilen. Hierdoor is het noodzakelijk om methoden te ontwikkelen, zodat detectie van deze producten mogelijk wordt. In dit onderzoek wordt de metabolisatie van twee anabole androgene steroïden, namelijk methyldienolone en methyltrienolone, nagegaan.

Metabolisatiestudie van methyldienolone en methyltrienolone aan de hand van het chimeer muismodel en humane lever microsomen

Dopinggerelateerde producten worden veelvuldig gebruikt in de sportwereld door hun prestatie bevorderend effect en bovendien worden er telkens ook nieuwe producten op de markt gebracht om zo de dopingcontroles te kunnen omzeilen. Hierdoor is het noodzakelijk om methoden te ontwikkelen, zodat detectie van deze producten mogelijk wordt. In dit onderzoek wordt de metabolisatie van twee anabole androgene steroïden, namelijk methyldienolone en methyltrienolone, nagegaan. De metabolieten van beide dopinggerelateerde producten zijn weinig tot niet gekend en zouden op deze manier kunnen opgenomen worden in de routine screening ter detectie. De detectie van de steroïden zelf gebeurt in beperkte mate, want na inname worden ze omgezet in het lichaam tot metabolieten. Deze metabolieten laten een langere detectie van het misbruik toe dan het eigenlijk steroïde. Hierdoor is het dus belangrijk dat het metabolisme gekend is. De voornaamste detectiemethoden die hiervoor worden gebruikt zijn GC-MS en LC-MS.

De studie van de metabolisatie wordt uitgevoerd via in vivo en in vitro technieken. In vitro gaat men een metabolisatiestudie uitvoeren aan de hand van humane lever microsomen, om hierdoor het aantal dierproeven te reduceren en dus de vervanging toe te passen van de 3V’s voor verantwoorde proefdierexperimenten. In vivo maakt men gebruik van het uPA+/+-SCID muismodel die getransplanteerde humane hepatocyten bevatten, waarbij de excretie-urine wordt onderzocht van chimere muizen op zoek naar gevormde humane metabolieten. Er wordt eerst en vooral gebruik gemaakt van niet-chimere muizen om een dosisbepaling uit te voeren en ter controle van de excretie studie, waarna overgeschakeld wordt op het uPA+/+-SCID chimeer muismodel.

Het humaan metabolisme wordt bevestigd door het verkrijgen van dezelfde metabolieten in de humane lever microsomen als in het chimeer muismodel. Via analyse op GC-MS van methyldienolone wordt een metaboliet gedetecteerd die gevormd wordt door de mens en ook wordt bevestigd via detectie op LC-MS2. Bij de analyse van methyltrienolone, die enkel wordt gedetecteerd via LC-MS2, wordt eveneens een metaboliet gedetecteerd die wordt verkregen door het humaan metabolisme. Als metabolisatiereactie vinden hydroxylaties plaats van methyldienolone en methyltrienolone. Hierbij is het belangrijk om in een verder onderzoek de structuur van de metabolieten te achterhalen om methyldienolone en methyltrienolone specifieker te kunnen identificeren in de urine.

Bibliografie

[1] VAN EENOO, P. (2005). Doping Control Laboratory [on line]. Universiteit Gent.

       http://www.docolab.ugent.be [datum van opzoeking: 09/03/2014].

[2] World Anti-Doping Agency (WADA) (2014). Accredited Laboratories For Doping Control Analysis [on line].

       http://www.wada-ama.org/Documents/Science_Medicine/Anti-Doping_Laboratories/WADA_Accredited_Laboratories_EN.pdf [datum van opzoeking: 09/03/2014].

[3] MORENTE-SÁNCHEZ, J., ZABALA, M. (2013). Doping in Sport: A Review of Elite Athletes’ Attitudes, Beliefs, and Knowledge. Sports Medicine, 43(6), 395-411.

[4] World Anti-Doping Agency (WADA) (2012). Anti-Doping Testing Figures Report [on line].

       http://www.wada-ama.org/Documents/Resources/Testing-Figures/WADA-2012-Anti-Doping-Testing-Figures-Report-EN.pdf [datum van opzoeking: 16/03/2014].

[5] World Anti-Doping Agency (WADA) (2009). World Anti-Doping Code [on line].

       http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-The-Code/WADA_Anti-Doping_CODE_2009_EN.pdf [datum van opzoeking: 02/04/2014].

[6] World Anti-Doping Agency (WADA) (2009). WADA History [on line].

       http://www.wada-ama.org/en/About-WADA/History/WADA-History/ [datum van opzoeking: 16/03/2014].

[7] DUNTAS, L.H., POPOVIC, V. (2013). Hormones as doping in sports. Endocrine, 43(2), 303-13.

[8] World Anti-Doping Agency (WADA) (2014). The 2014 Prohibited List International Standard [on line].

       http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-Prohibited-list/2014/WADA-prohibited-list-2014-EN.pdf [datum van opzoeking: 16/03/2014].

[9] KICMAN, A.T. (2008). Pharmacology of anabolic steroids. British Journal of Pharmacology, 154, 502-521.

[10] SCHÄNZER, W. (1996). Metabolism of anabolic androgenic steroids. Clinical Chemistry, 42:7, 1001-1020.

[11] HARTGENS, F., KUIPERS, F. (Eds.) (2000). Verboden middelen in de sport. Bohn Stafleu Van Loghum, Houten/Diegem, 266p. (ISBN 90-313-2778-6)

[12] FRAGKAKI, A.G., ANGELIS, Y.S., KOUPPARIS, M., TSANTILI-KAKOULIDOU, A., KOKOTOS, G., GEORGAKOPOULOS, C. (2009). Structural characteristics of anabolic androgenic steroids contributing to binding to the androgen receptor and to their anabolic and androgenic activities. Applied modifications in the steroidal structure. Steroids, 74, 172-197.

[13] SCHÄNZER, W., DONIKE, M. (1993). Metabolism of anabolic steroids in man: synthesis and use of reference substances for identification of anabolic steroid metabolites. Analytica Chimica Acta, 275, 23-48.

[14] LOOTENS, L., MEULEMAN, P., POZO, O.J., VAN EENOO, P., LEROUX-ROELS, G., DELBEKE, F.T. (2009). uPA+/+-SCID Mouse with Humanized Liver as a Model for In Vivo Metabolism of Exogenous Steroids: Methandienone as a Case Study. Clinical Chemistry, 55:10, 1783-1793.

[15] DE GROOT, A., KOERT, W. (2007). Prohormonen [on line]. Ergogenics.

       http://www.ergogenics.org/anabolenboek/index15.html [datum van opzoeking: 02/04/2014].

[16] MOSS, G.P. (1989). Nomenclature Of Steroids. Pure and Applied Chemistry, 61:10, 1783-1822.

[17] DE GROOT, A., KOERT, W. (2006). De Structuurformule van Testosteron [on line]. Ergogenics.

       http://www.ergogenics.org/anabolenboek/index4.html [datum van opzoeking: 07/04/2014].

[18] Pharmacology Education Partnership (PEP) (2003). Steroids and athletes: Genes work overtime [on line].

       http://www.thepepproject.net/Load/teacher/PEP_M6.pdf [datum van opzoeking: 08/04/2014].

[19] DEMEYERE, M. (2012). De genexpressie. De Hogeschool West-Vlaanderen, Brugge, 188p.

[20] BRANDON, E.F.A., RAAP, C.D., MEIJERMAN, I., BEIJNEN, J.H., SCHELLENS, J.H.M. (2003). An update on in vitro test methods in human hepatic drug biotransformation research: pros and cons. Toxicology and Applied Pharmacology, 189, 233-246.

[21] LEE, J., XIAODONG, L. (2007). The Conduct of Drug Metabolism Studies Considered Good Practice (II): In Vitro Experiments. Current Drug Metabolism, 8(8), 822-829.

[22] FASINU, P., BOUIC, P.J., ROSENKRANZ, B. (2012). Liver-Based In Vitro Technologies for Drug Biotransformation Studies. Current Drug Metabolism, 13, 000-000.

[23] EMOTO, C., IWASAKI, K., MURAYAMA, N., YAMAZAKI, H. (2011). Drug Metabolism and Toxicity in Chimeric Mice with Humanized Liver. Journal of Health Science, 57(1), 22-27.

[24] KATOH, M., TATENO, C., YOSHIZATO, K., YOKOI, T. (2008). Chimeric mice with humanized liver. Toxicology, 246, 9-17.

[25] JANCOVA, P., ANZENBACHER, P., ANZENBACHEROVA, E. (2010). Phase II Drug Metabolizing Enzymes. Biomedical Papers of the Medical Faculty of the University Palacky Olomouc Czech Republic, 154(2), 103-116.

[26] Mind and Muscle (2011). Prohormones: Methyldienolone [on line].

       http://www.mindandmuscle.net/articles/prohormones-methyldienolone/ [datum van opzoeking: 21/04/2014].

[27] Mind and Muscle (2011). Anabolic Steroids: Methyltrienolone [on line].

       http://www.mindandmuscle.net/articles/anabolic-steroids-methyltrienolone/ [datum van opzoeking: 21/04/2014].

[28] KICKMAN, A.T. GOWER, D.B. (2003). Anabolic steroids in sport: biochemical, clinical and analytical perspectives. Annals of clinical biochemistry, 40, 321-356.

[29] THEVIS, M., SCHÄNZER, W. (2007). Mass Spectrometry In Sports Drug Testing: Structure Characterization And Analytical Assays. Mass Spectrometry Reviews, 26, 79-107.

[30] POZO, O.J., LOOTENS, L., VAN EENOO, P., DEVENTER, K., MEULEMAN, P., LEROUX-ROELS, G., PARR, M.K., SCHÄNZER, W., DELBEKE, F.T. (2009). Combination of liquid-chromatography tandem mass spectrometry in different scan modes with human and chimeric mouse urine for the study of steroid metabolism. Drug Testing and Analysis, 1, 554-567.

[31] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G., MAASKANT, J., SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (1996). Chromatografie in de praktijk. Gaschromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN 90-71694-34-8)

[32] SALLIAU, S. (2012). Instrumentele technieken. Chromatografie. De Hogeschool West-Vlaanderen, Brugge, 104p.

[33] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G., SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (1997). Chromatografie in de praktijk. Gaschromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN 90-71694-35-6)

[34] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G., SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (1995). Chromatografie in de praktijk. Vloeistofchromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN 90-71694-35-6)

[35] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G., SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (2001). Chromatografie in de praktijk. Vloeistofchromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN 90-71694-35-6)

[36] GATES, P. (2009). Quadruple & Triple Quadrupole (QQQ) Mass Analysis [on line]. University of Bristol.

       http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.html [datum van opzoeking: 24/04/2014].

[37] POZO, O.J., DEVENTER, K., VAN EENOO, P., DELBEKE, F.T. (2008). Efficient Approach for the Comprehensive Detection of Unknown Anabolic Steroids and Metabolites in Human Urine by Liquid Chromatography-Electrospray-Tandem Mass Spectrometry. Analytical chemistry, 80(5), 1709-1720.

[38] GATES, P. (2004). Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) [on line]. University of Bristol.

       http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/tandem-ms.html [datum van opzoeking: 24/04/2014].

[39] LOOTENS, L., VAN EENOO, P., MEULEMAN, P., LEROUX-ROELS, G., DELBEKE, F.T. (2009). The uPA (+/+)-SCID Mouse with Humanized Liver as a Model for in Vivo Metabolism of 4-Androstene-3,17-dione. Drug Metabolism and Disposition, 37(12), 2367-2374.

[40] MEULEMAN, P., LEROUX-ROELS, G. (2008). The human liver-uPA-SCID mouse: A model for the evaluation of antiviral compounds against HBV and HCV. Antiviral research, 80(3), 231-238.

[41] MEULEMAN, P., LIBBRECHT, L., DE VOS, R., DE HEMPTINNE, B., GEVAERT, K., VANDEKERCKHOVE, J., ROSKAMS, T., LEROUX-ROELS, G. (2005). Morphological and Biochemical Characterization of a Human Liver in a uPA‐SCID Mouse Chimera. Hepatology, 41(4), 847-856.

[42] BD Biosciences (2012). NADPH Regenerating System Solution A & B. BD Gentest, Woburn, 2p.

[43] COTTYN, A., VAN OOSTVELDT, K. (2013). In vivo en in vitro technieken. Proefdierkunde en weefselkweek. De Hogeschool West-Vlaanderen, Brugge, 86p.

[44] FRAGKAKI, A.G., ANGELIS, Y.S., TSANTILI-KAKOULIDOU, A., KOUPPARIS, M., GEORGAKOPOULOS, C. (2009). Statistical analysis of fragmentation patterns of electron ionization mass spectra of enolized-trimethylsilylated anabolic androgenic steroids. International Journal of Mass Spectrometry, 285(1), 58-69.

[45] GEYER, H., PARR, M.K., KOEHLER, K., MARECK, U., SCHÄNZER, W., THEVIS, M. (2008). Nutritional supplements cross‐contaminated and faked with doping substances. Journal of mass spectrometry, 43(7), 892-902.

Universiteit of Hogeschool
Biomedische laboratoriumtechnologie
Publicatiejaar
2014
Promotor(en)
X
Kernwoorden
Share this on: