De impact van buffers op de adsorptie van globine in mesoporeus titania

Jacotte Brokken
Maaltijden zonder mysterie dankzij de biosensorVoedsel. Voor de meesten is het gewoon een onderdeel van het leven, maar voor mensen met voedselallergieën is het een bron van miserie. Zij moeten elke dag de zoektocht naar veilig voedsel overleven, iets wat geen probleem is in hun eigen keuken, maar tot pijnlijke gevolgen kan leiden van zodra ze die cocon verlaten. Dat ze dan moeten vertrouwen op de goede wil van obers of verpakkingen, is in deze tijd volledig achterhaald. Hier moet een eenvoudigere, meer betrouwbare manier voor zijn.

De impact van buffers op de adsorptie van globine in mesoporeus titania

Maaltijden zonder mysterie dankzij de biosensor

Voedsel. Voor de meesten is het gewoon een onderdeel van het leven, maar voor mensen met voedselallergieën is het een bron van miserie. Zij moeten elke dag de zoektocht naar veilig voedsel overleven, iets wat geen probleem is in hun eigen keuken, maar tot pijnlijke gevolgen kan leiden van zodra ze die cocon verlaten. Dat ze dan moeten vertrouwen op de goede wil van obers of verpakkingen, is in deze tijd volledig achterhaald. Hier moet een eenvoudigere, meer betrouwbare manier voor zijn. En eureka, hulp is onderweg.

De biosensor

Mag ik u voorstellen aan de biosensor: een eenvoudig, draagbaar toestel, dat het mogelijk maakt om zelf je voedsel te analyseren. Meer nog, deze toestellen kunnen niet alleen gebruikt worden om de ingrediënten te achterhalen, maar ook om de houdbaarheid en de algemene veiligheid te meten. Vooraleer jij en ik echter een biosensor in onze keukenschuif hebben liggen, moet de wetenschap nog een flink stuk evolueren. De huidige biosensoren zijn namelijk niet stabiel genoeg en ook de signaaloverdracht bij detectie moet beter kunnen. Die twee uitdagingen werden in deze thesis aangepakt.

Maar laat me vooral beginnen bij het begin…

What’s in a name?

Een biosensor is een meettoestel dat bestaat uit biomoleculen enerzijds en een detector anderzijds. In deze thesis werden eiwitten (ook proteïnen genoemd) gebruikt als biomoleculen, dus laat ons voor de eenvoud daar op focussen. Wanneer een biosensor wordt gebruikt om een staal te analyseren, zullen deze eiwitten specifiek reageren met de moleculen in dat staal. Die reactie zorgt voor een signaal dat naar de detector wordt overgebracht, waar je het resultaat kan aflezen. Dit signaal geeft informatie over zowel de soort moleculen in het staal, als hun concentratie. In theorie is dit een heel succesvol systeem. In praktijk is er echter één groot nadeel aan eiwitten: hun stabiliteit. Net zoals het eiwit in een kippenei van vloeibaar tot vast verandert bij opwarming, veranderen eiwitten ook op microscopische schaal onder invloed van bv. temperatuur. Een eiwitmolecule ziet er namelijk uit als een touw. In stabiele vorm is dit touw stevig opgerold tot een bolletje. Verandering van temperatuur of zuurtegraad kan er echter voor zorgen dat dit bolletje afrolt. Hierdoor verliest het eiwit zijn activiteit en wordt de biosensor waardeloos. Dit afrollen wordt denaturatie genoemd. In dit onderzoek werd getracht denaturatie te voorkomen door verschillende strategieën uit te testen.

Strategie 1: Buffers

Zoals eerder gezegd, is de stabiliteit van de eiwitten o.m. afhankelijk van de zuurtegraad. Daarom worden eiwitten niet in zuiver water opgelost, maar in een bufferoplossing. Buffermoleculen zorgen er namelijk voor dat de zuurtegraad in een oplossing constant wordt gehouden. In deze thesis werden drie verschillende buffers uitgetest: PBS, Tris en Hepes. Uit experimenten is gebleken dat Tris de zuurtegraad en dus de activiteit van de eiwitten het langst stabiel kan houden.

Strategie 2: Immobilisatie

You’ve got mail

Zoals je ondertussen weet, wordt er een signaal gecreëerd wanneer het eiwit reageert met de moleculen in het staal. Het overbrengen van het signaal naar de detector verloopt in de meeste gevallen echter niet optimaal. In het verleden werd hier al een oplossing voor bedacht: de mediator. Mediatormoleculen brengen het signaal van bij het eiwit tot bij de detector, zoals een postbode dat zou doen. In dit onderzoek wordt echter een nieuwe strategie uitgevoerd, nl. immobilisatie. Als mediatoren postbodes zijn, dan is immobilisatie te vergelijken met een e-mail sturen. Het is sneller en je bent minder afhankelijk van de werking van de postbode/mediator (en of die onderweg al eens graag een babbeltje slaat).

Immobi-Wan?

Maar wat wordt dan met immobilisatie bedoeld? Immobilisatie is het aanbrengen van eiwitmoleculen op een drager, zodat ze niet meer vrij kunnen bewegen en dus ‘immobiel’ worden. Dit eiwit-drager complex wordt vervolgens op de detector aangebracht, waardoor een rechtstreekse verbinding wordt gevormd tussen eiwit en detector. De overdracht van het signaal zal hierdoor verbeterd worden, maar ook de stabiliteit wordt geoptimaliseerd, aangezien de drager voorkomt dat het eiwit afrolt/ denatureert. Zie het als het lijmen van een bolletje touw op een stuk karton. Op die manier wordt afrollen moeilijker. Wanneer je dat bolletje touw echter vastlijmt in een kartonnen doosje, dat ongeveer even groot is als het bolletje touw, wordt afrollen nog moeilijker. Deze strategie wordt in dit onderzoek ook onderzocht. Er wordt daarom geen vlak dragermateriaal gebruikt, maar een poreus materiaal, d.w.z. een materiaal dat poriën bevat, vergelijkbaar met een spons of gatenkaas. Door de eiwitten in die poriën te immobiliseren wordt niet alleen de signaaloverdracht, maar ook de stabiliteit verbeterd.

Combinatie van buffer en immobilisatie

De grote uitdaging in deze thesis was echter het combineren van beide strategieën. De buffermoleculen mogen namelijk de immobilisatie niet verhinderen door bijvoorbeeld zelf te ‘kleven’ op het oppervlak en in de poriën. Na uitproberen van de drie buffers, bleek PBS de minst geschikte buffer te zijn. Deze interageert namelijk te intens met het oppervlak, waardoor alle bindingssites voor het eiwit bezet werden. Hepes daarentegen, interageert helemaal niet met het oppervlak, maar stabiliseert het eiwit ook niet. De meest geschikte buffer is daarom Tris, ook al reageert deze wel met het oppervlak. Door die interactie vormt Tris namelijk betere bindingssites voor het eiwit, waardoor dit sterker interageert met het oppervlak. Bovendien werden meer eiwitmoleculen in de poriën geïmmobiliseerd dan bij de andere buffers.

Conclusie

Hoewel deze thesis slechts het topje van de biosensor-ijsberg behandelt, werden belangrijke resultaten bekomen. Voor de optimale werking van biosensoren is het immers noodzakelijk dat ze stabiel blijven en de signaaloverdracht op een vlotte manier gebeurt. Deze thesis heeft alvast een oplossing geboden voor de stabiliteit, nl. het gebruik van de juiste buffer (Tris) en het immobiliseren van de eiwitten. Bijkomende metingen zullen uitwijzen welke impact deze strategieën hebben op de signaaloverdracht. Vooraleer de biosensor standaard in elke keuken aanwezig is, zal er dus nog veel onderzoek moeten gebeuren, maar deze thesis werd alvast een eerste stap in de goede richting. 

Bibliografie

1.        Yu, J. & Ju, H. Amperometric biosensor for hydrogen peroxide based on hemoglobin entrapped in titania sol-gel film. Anal. Chim. Acta 486, 209–216 (2003).

2.        Faridbod, F., Gupta, V. K. & Zamani, H. A. Electrochemical Sensors and Biosensors 2012. 2011, (2011).

3.        Canbay, E., Şahin, B., Kıran, M. & Akyilmaz, E. MWCNT–cysteamine–Nafion modified gold electrode based on myoglobin for determination of hydrogen peroxide and nitrite. Bioelectrochemistry 101, 126–131 (2015).

4.        Mandal, S. S., Navratna, V., Sharma, P., Gopal, B. & Bhattacharyya, A. J. Titania nanotube-modified screen printed carbon electrodes enhance the sensitivity in the electrochemical detection of proteins. Bioelectrochemistry 98, 46–52 (2014).

5.        Zhang, X., Ju, H. & Wang, J. in Electrochemical Sensors, Biosensors and their Biomedical Applications xxi–xxii (Elsevier Inc., 2008).

6.        Justin Gooding, J. Nanoscale biosensors: Significant advantages over larger devices? Small 2, 313–315 (2006).

7.        Schaepelynck, P. et al. Advances in pump technology: Insulin patch pumps, combined pumps and glucose sensors, and implanted pumps. Diabetes Metab. 37, S85–S93 (2011).

8.        Miyahara, M., Vinu, A. & Ariga, K. Adsorption myoglobin over mesoporous silica molecular sieves: Pore size effect and pore-filling model. Mater. Sci. Eng. C 27, 232–236 (2007).

9.        Guo, C., Hu, F., Li, C. M. & Shen, P. K. Direct electrochemistry of hemoglobin on carbonized titania nanotubes and its application in a sensitive reagentless hydrogen peroxide biosensor. Biosens. Bioelectron. 24, 819–824 (2008).

10.      Turdean, G. L. & Szabo, G. Nitrite detection in meat products samples by square-wave voltammetry at a new single walled carbon naonotubes – myoglobin modified electrode. Food Chem. 179, 325–330 (2015).

11.      Chaudhary, Y. S., Manna, S. K., Mazumdar, S. & Khushalani, D. Protein encapsulation into mesoporous silica hosts. Microporous Mesoporous Mater. 109, 535–541 (2008).

12.      Gupta, P., Vermani, K. & Garg, S. Hydrogels: From controlled release to pH-responsive drug delivery. Drug Discov. Today 7, 569–579 (2002).

13.      Ivnitski, D., Abdel-Hamid, I., Atanasov, P. & Wilkins, E. Biosensors for detection of pathogenic bacteria. Biosens. Bioelectron. 14, 599–624 (1999).

14.      Mongra, a. C. Commercial Biosensors : An outlook. J. Acad. Indus. Res. 1, 310–312 (2012).

15.      Barker, S. A. in Biosensors Fundamentals and Applications (eds. Turner, A. P. F., Karube, I. & Wilson, G. S.) 85 – 99 (Oxford University Press, 1987).

16.      Atkins, P. et al. Inorganic Chemistry X-ray stuff. Inorg. Chem. 223–226 (2009).

17.      Essa, H., Magner, E., Cooney, J. & Hodnett, B. K. Influence of pH and ionic strength on the adsorption, leaching and activity of myoglobin immobilized onto ordered mesoporous silicates. J. Mol. Catal. B Enzym. 49, 61–68 (2007).

18.      Stoker, H. S. General, Organic, and Biological Chemistry. (Brooks Cole, 2010).

19.      Satyawali, Y. et al. Characterization and analysis of the adsorption immobilization mechanism of β-galactosidase on metal oxide powders. RSC Adv. 3, 24054 (2013).

20.      Xian, Y. et al. Encapsulation hemoglobin in ordered mesoporous silicas: Influence factors for immobilization and bioelectrochemistry. Electrochem. commun. 9, 142–148 (2007).

21.      Dai, Z. & Ju, H. Bioanalysis based on nanoporous materials. TrAC - Trends Anal. Chem. 39, 149–162 (2012).

22.      Asano, T., Tsuru, K., Hayakawa, S. & Osaka, A. Bilirubin adsorption property of sol-gel-derived titania particles for blood purification therapy. Acta Biomater. 4, 1067–1072 (2008).

23.      Sun, J. Y., Huang, K. J., Zhao, S. F., Fan, Y. & Wu, Z. W. Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin on chitosan-room temperature ionic liquid-TiO   2-graphene nanocomposite film modified electrode. Bioelectrochemistry 82, 125–130 (2011).

24.      Comini, E., Galstyan, V., Faglia, G., Bontempi, E. & Sberveglieri, G. Highly conductive titanium oxide nanotubes chemical sensors. Microporous Mesoporous Mater. 208, 165–170 (2015).

25.      Rabe, M., Verdes, D. & Seeger, S. Understanding protein adsorption phenomena at solid surfaces. Adv. Colloid Interface Sci. 162, 87–106 (2011).

26.      Gumy, D. et al. Catalytic activity of commercial of TiO2 powders for the abatement of the bacteria (E. coli) under solar simulated light: Influence of the isoelectric point. Appl. Catal. B Environ. 63, 76–84 (2006).

27.      Gibbs, J. Optimizing the Immobilization of Protein and Other Biomolecules. (2001).

28.      Meersman, F., Smeller, L. & Heremans, K. Comparative Fourier transform infrared spectroscopy study of cold-, pressure-, and heat-induced unfolding and aggregation of myoglobin. Biophys. J. 82, 2635–2644 (2002).

29.      Gäb, J., John, H., Melzer, M. & Blum, M. M. Stable adducts of nerve agents sarin, soman and cyclosarin with TRIS, TES and related buffer compounds-Characterization by LC-ESI-MS/MS and NMR and implications for analytical chemistry. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 878, 1382–1390 (2010).

30.      Guerrero, G., Mutin, P. H. & Vioux, a. Anchoring of phosphonate and phosphinate coupling molecules on titania particles. Chem. Mater. 13, 4367–4373 (2001).

31.      Ribbens, S. et al. Systematic evaluation of thermal and mechanical stability of different commercial and synthetic photocatalysts in relation to their photocatalytic activity. Microporous Mesoporous Mater. 156, 62–72 (2012).

32.      Samantaray, S. K. & Parida, K. Studies on anion-promoted titania 3. Effect of concentration and source of phosphate ion, method of preparation, and activation temperature on redox, acid-base, textural and catalytic properties of titania. J. Mol. Catal. A Chem. 176, 151–163 (2001).

33.      Kadam, D. M. et al. Preparation and characterization of whey protein isolate films reinforced with porous silica coated titania nanoparticles. J. Food Eng. 117, 133–140 (2013).

34.      Kholodenko, Y., Volk, M., Gooding, E. & Hochstrasser, R. M. Energy dissipation and relaxation processes in deoxy myoglobin after photoexcitation in the Soret region. Chem. Phys. 259, 71–87 (2000).

35.      Anderson, a B. & Robertson, C. R. Absorption spectra indicate conformational alteration of myoglobin adsorbed on polydimethylsiloxane. Biophys. J. 68, 2091–2097 (1995).

36.      Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 1767, 1073–1101 (2007).

37.      Chen, X. D., Wang, Z., Liao, Z. F., Mai, Y. L. & Zhang, M. Q. Roles of anatase and rutile TiO2 nanoparticles in photooxidation of polyurethane. Polym. Test. 26, 202–208 (2007).

38.      Sing, K. The use of nitrogen adsorption for the characterisation of porous materials. Colloids Surfaces A Physicochem. Eng. Asp. 187-188, 3–9 (2001).

39.      Brown, M. E. & Gallagher, P. K. in Handbook of Thermal Analysis and Calorimetry (eds. Brown, M. E. & Gallagher, P. K.) 5, 1–12 (Elsevier B.V., 2008).

40.      Barboux-Doeuff, S. & Sanchez, C. Synthesis and Characterization of Titanium Oxide-Based Gels Synthesized from Acetate Modified Titanium Butoxide Precursors. Mat. Res. Bull. 29, 1–13 (1994).

41.      Stuart, B. Infrared Spectroscopy: Fundamentals and Applications. (John Wiley & Sons Ltd, 2004).

42.      Adler, H. H. Infrared spectra of phosphate minerals: symmetry and substitutional effects in the pyromorphite series. Am. Mineral. 49, 1002–1015 (1964).

43.      Kaiden, K., Matsui, T. & Tanaka, S. Study of the Amide III Band by FT-IR Spectrometry of the Secondary Structure of Albumin, Myoglobin and gamma-Globulin. Appl. Spectrosc. 41, 180–184 (1987).

44.      Rubio, J., Oteo, J. L., Villegas, M. & Duran, P. Characterization and Sintering Behaviour of Submicrometre Titanium Dioxide Spherical Particles Obtained by Gas-Phase Hydrolysis of Titanium Tetrabutoxide. J. Mater. Sci. 32, 643–652 (1997).

45.      Nijhuis, T. A., Visser, T. & Weckhuysen, B. M. The role of gold in gold-titania epoxidation catalysis. Angew. Chemie - Int. Ed. 44, 1115–1118 (2005). 

Universiteit of Hogeschool
Master in de Chemie
Publicatiejaar
2015
Kernwoorden
Deel deze scriptie