Expression and study of the stability of a bacterial lytic polysaccharide monooxygenase

Matthias Last Magali Tanghe
Een studie rond de expressie en de stabiliteit van een LPMO. Het beoogde doel is het stabiliseren van het enzym, teneinde het gebruik in enzymmixen voor cellulose afbraak tot fermenteerbare suikereenheden. Zodanig kan cellulose gebruikt worden als hernieuwbare grondstof.

Plantenafval als waardevolle grondstof?

Plantenafval als waardevolle grondstof?

In tijden van de opwarming van de aarde en steeds afnemende voorraden aan fossiele grondstoffen, registreerde het “renewables global status report” van 2016 toch een stijging in verbruik van petroleum van 127 miljoen ton, 2,6 keer hoger dan de stijging in verbruik van hernieuwbare bronnen. Plantenafval biedt met cellulose echter waardevolle alternatieven voor petroleum gebaseerde producten. Cellulose is als het meest voorkomende bio-polymeer ter wereld een interessante potentiële leverancier van een waaier aan waardevolle producten.

Rendabiliteit van een bio-gebaseerde industrie

Door een steeds toenemend verbruik, komen de natuurlijke voorraden aan fossiele grondstoffen steeds meer onder druk te staan. Samen met het zich manifesteren van de gevolgen van de opwarming van de aarde, zorgt dit zo voor een steeds groeiende interesse in hernieuwbare grondstoffen en een evolutie naar een meer duurzame bio-gebaseerde industrie. Daar de huidige technologieën voor een duurzamere industrie hoofdzakelijk gebaseerd zijn op het gebruik van voedingsgewassen zoals bio-ethanol uit graan, zou grootschalig gebruik bijgevolg resulteren in stijgende voedselprijzen.

Een potentieel interessante alternatief is het gebruik van cellulose uit plantaardige reststromen zoals papierafval, pulp, vlasresten, (snoei-)hout, bermgras en landbouwresidu's. Aangezien cellulose het meest voorkomende bio-polymeer ter wereld is en de plantaardige materialen bij hun aanmaak reeds bijdroegen tot het CO2 verbruik, kunnen zij gezien worden als een duurzame hernieuwbare voorziening. Door daarbij vooral te focussen op reststromen, kan hierdoor ook de invloed op de grondstofprijzen voor andere industrieën beperkt worden.

 

 

 

 

 

 

 

 

Image removed. Problematische afbraak

In deze evolutie naar een duurzame economie, wordt de toepassing van cellulose voor de bio-ethanolproductie echter bemoeilijkt door zijn kristalliene structuur. Mede door deze structuur ontstaat namelijk een enorme weerstand tegenover conventionele enzymatische afbraak. Hoewel dit voordelig is voor de stevigheid van de plantencelwand, resulteert het in een nood aan een complex enzymatisch mengsel bij de voorbehandeling van cellulose tot hernieuwbare grondstof. Door het vaak ontoereikend afbraakvermogen van de klassieke enzymenmengsels, werd de rendabiliteit van cellulose als duurzaam alternatief voor fossiele grondstoffen vaak in twijfel getrokken.

De oplossing?

De recent ontdekte LPMO enzymen (Lytische Polysaccharide Mono-Oxygenases)  worden nu echter door vele onderzoeksgroepen aanzien als de ontbrekende factor voor een efficiënte enzymatische cellulose afbraak. Door hun opbouw kunnen ze zelfs in de kristalliene structuur de glucoseketens verbreken, waardoor stukken cellulose polymeer uit de structuur uitsteken en beschikbaar worden voor de cellulasen in de conventionele enzym mixen. Zo zullen ze bijdragen tot de afbraak en stimuleren ze tevens de activiteit van de klassieke enzymen. De succesvolle toepassing van LPMO’s als onderdeel van die enzymenmengsels vereist echter voldoende stabiliteit, om gedurende het verloop van de processen te overleven bij de vereiste temperaturen. Daarom omvatte het doel van dit onderzoek de verhoging van de thermische stabiliteit van een specifiek LPMO, namelijk Sterptomyces coelicolor  LPMO10C. Hiervoor werden de effecten van verschillende modificaties gemeten en geëvalueerd.

Het onderzoek

Als eerste stap werd een expressiesysteem op punt gesteld waarbij de correcte amino-terminus van het eiwit verzekerd werd en vervolgens geoptimaliseerd om voldoende eiwitopbrengst en zuiverheid te verkrijgen. Reeds verschillende onderzoeken hebben namelijk al aangetoond dat dit eiwit uiteinde cruciaal is voor de interacties die een koper-ion in het actieve centrum van het enzym fixeren. Dit koper ion is op zijn beurt onmisbaar voor de cellulose afbrekende activiteit. In dit onderzoek werd echter ook onderzocht wat het effect is van deze koper bindende amino-terminus op de stabiliteit. Uit deze testen bleek, dat bij het verbreken van de koper fixerende interacties van het amino-terminale einde van het enzym, dit niet alleen resulteert in het verlies aan activiteit, maar ook zal zorgen dat het enzym al denatureert bij een 7°C lagere temperatuur.

Vervolgens werden de meest flexibele regio’s van het enzym bepaald met röntgenstraal kristallografie en het algoritme van het B-fitter computerprogramma. Vertrekkende van de wetenschap dat de meest bewegende delen eerst zullen afbreken, werden deze meest flexibele regio’s aanzien als meest kwetsbare. Bijgevolg werden deze dan ook gebruikt als doelwit voor mutagenese, om ze door middel van extra interacties te fixeren op de meer rigide regio’s. Eén set gemuteerde enzymen betrof de introductie van zout bruggen, ionische netwerken en meer polaire residuen op het eiwitoppervlak, terwijl een andere set gebaseerd  was op de introductie van zwavelbruggen. Na productie werd de activiteit van deze mutanten getest door ze te incuberen met een cellulosesubstraat (cellulose behandeld met fosforzuur) en de afbraakproducten te scheiden, kwantificeren en analyseren (via High Performance Anion Exchange Chromatography met Pulsed Amperometric Detection). Verder werd via differential scanning fluorimetry (DSF) ook de smelttemperatuur gemeten. Hierbij fungeert de temperatuur waarbij het enzym maximaal ontvouwt, als maat voor de thermostabiliteit.

Resultaat

Bij het meten van de activiteit, bleek geen enkele van de extra ingevoerde interacties de oxidatieve splitsing van cellulose te verhinderen. Terwijl de activiteit op cellulose dus steeds gevrijwaard bleef, resulteerden niet alle mutaties in een verhoogde thermostabiliteit. In verschillende gevallen, was er geen noemenswaardig verschil te detecteren of resulteerde de extra interactie vermoedelijk in een verwrongen 3D-structuur van het enzym, waardoor de mutant reeds bij een lagere temperatuur denatureerde. Toch bleek de uitgewerkte methode succesvol, aangezien 4 mutanten na introductie van een extra zwavelbrug resulteerden in een verhoogde smelttemperatuur (2 keer +3 °C, 1 keer +5 °C en ook 1 keer +9° C). Hiervan werden vervolgens combinaties van de verschillende mutaties toegepast om te controleren op cumulatieve effecten naar stabiliteit toe. Terwijl sommige combinaties van mutaties elkaar teniet deden, bleek één combinatie te resulteren in een verbetering in stabiliteit die de exacte som was van de verbeteringen van de individuele mutaties.

De bijdrage aan een duurzamere toekomst

Uiteindelijk werd 1 finale combinatie van twee mutaties gemaakt, waarvan de temperatuur waarbij het denatureerde verhoogd werd van 51°C voor het wild type naar 63 °C voor de mutant. Hiermee is dit onderzoek voor zo ver we weten, het eerste onderzoek dat resulteert in een verhoogde thermostabiliteit van een LPMO. Hoewel verdere testen en optimalisatie vereist zijn voor de succesvolle implementatie van LPMO’s in de cellulose afbrekende enzymenmengsels, zou dit resultaat een belangrijke bijdrage kunnen leveren aan de ontwikkeling van een rendabel proces om van cellulose uit plantenafval een duurzame hernieuwbare grondstof te maken.

Bibliografie

Ã, C. N. H., & Hooijdonk, G. Van. (2005). Ethanol from lignocellulosic biomass : techno-economic performance in short- , middle- and long-term, 28, 384–410. http://doi.org/10.1016/j.biombioe.2004.09.002

Aachmann, F. L., Sørlie, M., Skjåk-bræk, G., Eijsink, V. G. H., & Vaaje-kolstad, G. (2012). NMR structure of a lytic polysaccharide monooxygenase provides insight into copper binding , protein dynamics , and substrate interactions, 109(46). http://doi.org/10.1073/pnas.1208822109

Aerts, D., & Desmet, T. (2011). A constitutive expression system for high- throughput screening, (1), 10–19. http://doi.org/10.1002/elsc.201000065

Aerts, D., Verhaeghe, T., Joosten, H.-J., Vriend, G., Soetaert, W., & Desmet, T. (2013). Consensus engineering of sucrose phosphorylase: The outcome reflects the sequence input. Biotechnology and Bioengineering, 110(10), 2563–2572. http://doi.org/10.1002/bit.24940

Agger, J. W., Isaksen, T., Várnai, A., Vidal-melgosa, S., Willats, W. G. T., & Ludwig, R. (2014). Discovery of LPMO activity on hemicelluloses shows the importance of oxidative processes in plant cell wall degradation, 111(17). http://doi.org/10.1073/pnas.1323629111

Balat, M., & Balat, H. (2009). Recent trends in global production and utilization of bio-ethanol fuel. Applied Energy, 86(11), 2273–2282. http://doi.org/10.1016/j.apenergy.2009.03.015

Bayer, E. A., Lamed, R., & Himmel, M. E. (2007). The potential of cellulases and cellulosomes for cellulosic waste management, (Figure 1). http://doi.org/10.1016/j.copbio.2007.04.004

Beeson, W. T., Phillips, C. M., Cate, J. H. D., & Marletta, M. A. (2012). Oxidative Cleavage of Cellulose by Fungal Copper-Dependent Polysaccharide Monooxygenases, 2011–2013.

Betz, S. F. (1993). Disulfide bonds and the stability of globular proteins, 1551–1558.

Bommarius, A. S., Blum, J. K., & Abrahamson, M. J. (2011). Status of protein engineering for biocatalysts : how to design an industrially useful biocatalyst. Current Opinion in Chemical Biology, 15(2), 194–200. http://doi.org/10.1016/j.cbpa.2010.11.011

Borchert, T. V, Burg, B. Van Den, Eijsink, V. G. H., & Ga, S. (2005). Directed evolution of enzyme stability ˚, 22, 21–30. http://doi.org/10.1016/j.bioeng.2004.12.003

Cardona, C. A. (2007). Fuel ethanol production : Process design trends and integration opportunities, 98, 2415–2457. http://doi.org/10.1016/j.biortech.2007.01.002

Cerdobbel, A., De Winter, K., Aerts, D., Kuipers, R., Joosten, H.-J., Soetaert, W., & Desmet, T. (2011). Increasing the thermostability of sucrose phosphorylase by a combination of sequence- and structure-based mutagenesis. Protein Engineering Design and Selection, 24(11), 829–834. http://doi.org/10.1093/protein/gzr042

Chica, R. A., Doucet, N., & Pelletier, J. N. (2005). Semi-rational approaches to engineering enzyme activity : combining the benefits of directed evolution and rational design, 378–384. http://doi.org/10.1016/j.copbio.2005.06.004

Dani, V. S., Ramakrishnan, C., & Varadarajan, R. (2003). MODIP revisited : re-evaluation and refinement of an automated procedure for modeling of disulfide bonds in proteins, 16(3), 187–193. http://doi.org/10.1093/proeng/gzg024

Demain, A. L. (2000). Small bugs , big business : The economic power of the microbe, 18, 499–514.

Dies, G., Henrissat, B., Davies, G., & Henrissat, B. (1995). Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases.

Dombkowski, A. A., Zakia, K., & Craig, D. B. (2014). Protein disulfide engineering. FEBS Letters, 588(2), 206–212. http://doi.org/10.1016/j.febslet.2013.11.024

Eijsink, V. G. H., Bjørk, A., Sigrid, G., Sirev, R., Synstad, B., Burg, B. Van Den, & Vriend, G. (2004). Rational engineering of enzyme stability, 113, 105–120. http://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2004.03.026

Fágáin, C. Ó. (2003). Enzyme stabilization — recent experimental progress, 33, 137–149. http://doi.org/10.1016/S0141-0229(03)00160-1

Forsberg, Z., Mackenzie, A. K., Sørlie, M., Røhr, Å. K., Helland, R., Arvai, A. S., … Eijsink, V. G. H. (2014). Structural and functional characterization of a conserved pair of bacterial cellulose-oxidizing lytic polysaccharide monooxygenases, 111(23), 8446–8451. http://doi.org/10.1073/pnas.1402771111

Forsberg, Z., Røhr, Å. K., Mekasha, S., Kristo, K., Eijsink, V. G. H., Vaaje-kolstad, G., & Sørlie, M. (2014). Comparative Study of Two Chitin-Active and Two Cellulose-Active AA10-Type Lytic Polysaccharide Monooxygenases.

Forsberg, Z., Vaaje-kolstad, G., Westereng, B., Bunæs, A. C., Stenstrøm, Y., Mackenzie, A., … Eijsink, V. G. H. (2011). Cleavage of cellulose by a CBM33 protein, 20, 1479–1483. http://doi.org/10.1002/pro.689

Gianfreda, L., & Scarfi, M. R. (1991). Enzyme Stabilization : State of the Art, (MARCH 1991). http://doi.org/10.1007/BF00234161

Gray, K. A., Zhao, L., & Emptage, M. (2012). Bio-ethanol. http://doi.org/10.1016/j.cbpa.2006.02.035

Harmsen, P., & Huijgen, W. (2010). Literature Review of Physical and Chemical Pretreatment Processes for Lignocellulosic Literature Review of Physical and Chemical Pretreatment Processes for, (November 2015).

Hemsworth, G. R., Henrissat, B., Davies, G. J., & Walton, P. H. (2013). Discovery and characterization of a new family of lytic polysaccharide monooxygenases. Nature Chemical Biology, 10(2), 122–126. http://doi.org/10.1038/nchembio.1417

Hemsworth, G. R., Johnston, E. M., Davies, G. J., & Walton, P. H. (2015). Lytic Polysaccharide Monooxygenases in Biomass Conversion. Trends in Biotechnology, xx, 1–15. http://doi.org/10.1016/j.tibtech.2015.09.006

Horn, S. J., Vaaje-kolstad, G., Westereng, B., & Eijsink, V. G. H. (2012). Novel enzymes for the degradation of cellulose.

Isaksen, T., Westereng, B., Aachmann, F. L., Agger, J. W., Kracher, D., Kittl, R., … Horn, S. J. (2014). A C4-oxidizing Lytic Polysaccharide Monooxygenase Cleaving Both Cellulose and Cello-oligosaccharides. Journal of Biological Chemistry, 289(5), 2632–2642. http://doi.org/10.1074/jbc.M113.530196

Iyer, P. V., & Ananthanarayan, L. (2008). Enzyme stability and stabilization—Aqueous and non-aqueous environment. Process Biochemistry, 43(10), 1019–1032. http://doi.org/10.1016/j.procbio.2008.06.004

Jaenicke, R., & Gerald, B. (1998). The stability of proteins in extreme environments. Current Opinion in Structural Biology, 738–748.

Johnson, C. M. (2013). Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics, 531(1-2), 100–109. http://doi.org/10.1016/j.abb.2012.09.008

Jørgensen, H., & de Campos Giordano, R. (2015). Lignocellulose pretreatment technologies affect the level of enzymatic cellulose oxidation by LPMO Green Chemistry the level of enzymatic cellulose oxidation by. Green Chemistry, (February 2016). http://doi.org/10.1039/C4GC02179G

Kittl, R., Kracher, D., Burgstaller, D., Haltrich, D., & Ludwig, R. (2012). Production of four Neurospora crassa lytic polysaccharide monooxygenases in Pichia pastoris monitored by a fluorimetric assay. Biotechnology for Biofuels, 5(1), 79. http://doi.org/10.1186/1754-6834-5-79

Langston, J. A., Shaghasi, T., Abbate, E., Xu, F., Vlasenko, E., & Sweeney, M. D. (2011). Oxidoreductive Cellulose Depolymerization by the Enzymes Cellobiose Dehydrogenase and Glycoside Hydrolase 61 ᰔ †, 77(19), 7007–7015. http://doi.org/10.1128/AEM.05815-11

Leggio, L. Lo, Simmons, T. J., Poulsen, J. N., Frandsen, K. E. H., Hemsworth, G. R., Stringer, M. A., … Walton, P. H. (2015). Structure and boosting activity of a starch-degrading lytic polysaccharide monooxygenase. Nature Communications, 6, 1–9. http://doi.org/10.1038/ncomms6961

Levasseur, A., Drula, E., Lombard, V., Coutinho, P. M., & Henrissat, B. (2013). Expansion of the enzymatic repertoire of the CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes. Biotechnology for Biofuels, 6(1), 41. http://doi.org/10.1186/1754-6834-6-41

Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., & Wang, X. (2012). Technology Prospecting on Enzymes : Application , Marketing and Engineering, (September).

Li, X., Beeson, W. T., Phillips, C. M., Marletta, M. A., & Cate, J. H. D. (2012). Structural Basis for Substrate Targeting and Catalysis by Fungal Polysaccharide Monooxygenases. Structure, 20(6), 1051–1061. http://doi.org/10.1016/j.str.2012.04.002

Lin, M. Y., & Tanaka, S. (2006). Ethanol fermentation from biomass resources : current state and prospects, 627–642. http://doi.org/10.1007/s00253-005-0229-x

Lutz, S. (2010). Beyond directed evolution — semi-rational protein engineering and design. Current Opinion in Biotechnology, 21(6), 734–743. http://doi.org/10.1016/j.copbio.2010.08.011

Lynd, L. R., Weimer, P. J., Zyl, W. H. Van, & Pretorius, I. S. (2002). Microbial Cellulose Utilization : Fundamentals and Biotechnology, 66(3), 506–577. http://doi.org/10.1128/MMBR.66.3.506

Mallick, P., Boutz, D. R., Eisenberg, D., & Yeates, T. O. (2002). Genomic evidence that the intracellular proteins of archaeal microbes contain disulfide bonds, 99(15), 9679–9684.

Mateo, C., Abian, O., Lafuente, R. F., & Guisan, J. M. (2000). Increase in conformational stability of enzymes immobilized on epoxy-activated supports by favoring additional multipoint covalent attachment ૾, 26, 509–515.

Mateo, C., Palomo, J. M., Fernandez-lorente, G., Guisan, J. M., & Fernandez-lafuente, R. (2007). Improvement of enzyme activity , stability and selectivity via immobilization techniques, 40, 1451–1463. http://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2007.01.018

Matsumura, M., Signor, G., & Matthews, W. B. (1989). Substantial increase of protein stability by multiple disulphide bonds. Nature.

Matsumurat, M., Becktelt, W. J., Levitr, M., & Matthewstl, B. W. (1989). Stabilization of phage T4 Iysozyme by engineered disulfide bonds, 86(September), 6562–6566.

Mussatto, S. I., Dragone, G., Guimarães, P. M. R., Paulo, J., Silva, A., Carneiro, L. M., … Teixeira, J. A. (2010). Technological trends , global market , and challenges of bio-ethanol production. Biotechnology Advances, 28(6), 817–830. http://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2010.07.001

Naik, S. N., Goud, V. V, Rout, P. K., & Dalai, A. K. (2010). Production of first and second generation biofuels : A comprehensive review, 14, 578–597. http://doi.org/10.1016/j.rser.2009.10.003

Nannemann, D., Birmingham, W., Scism, R., & Bachmann, B. (2012). Assessing directed evolution methods for the generation of biosynthetic enzymes with potential in drug biosynthesis. Future Med Chem, 3(7), 809–819. http://doi.org/10.4155/fmc.11.48.Assessing

Polizzi, K. M., Bommarius, A. S., Broering, J. M., & Chaparro-Riggers, J. F. (2007). Stability of biocatalysts. Current Opinion in Chemical Biology, 11, 220–225. http://doi.org/10.1016/j.cbpa.2007.01.685

Promon, S. K., Program, B., & Sciences, N. (2015). Studies on Isolation of Yeasts from Natural Sources for Bio-ethanol production from Vegetable Peels and the Role of Cellulose Degrading Bacteria (Bacillus subtilis) on Ethanol Production, (August).

Ratanakhanokchai, K., Waeonukul, R., Sakka, K., Kosugi, A., & Mori, Y. (2013). Strain B-6 Multienzyme Complex : A Novel System for Biomass Utilization.

Reetz, M. T., Carballeira, J. D., & Vogel, A. (2006). Iterative saturation mutagenesis on the basis of b factors as a strategy for increasing protein thermostability. Angewandte Chemie - International Edition, 45(46), 7745–7751. http://doi.org/10.1002/anie.200602795

Robinson, C. R., & Sauer, R. T. (2000). Striking Stabilization of Arc Repressor by an Engineered Disulfide Bond †, 12494–12502.

Rodrigues, J., Prosinecki, V., Marrucho, I., & Rebelo, L. P. N. (2011). Protein stability in an ionic liquid milieu : on the use of differential scanning fluorimetry, (Cd), 13614–13616. http://doi.org/10.1039/c1cp21187k

Rowinska-Zyrek, M., Danuta, W., & Slawomir, P. (2013). His-rich sequences – is plagiarism from nature a good idea? †, 58–70. http://doi.org/10.1039/c2nj40558j

Sanchez-ruiz, J. M. (2010). Biophysical Chemistry Protein kinetic stability. Biophysical Chemistry, 148(1-3), 1–15. http://doi.org/10.1016/j.bpc.2010.02.004

Sanchis, J., Fernández, L., Carballeira, J. D., Drone, J., Gumulya, Y., Höbenreich, H., … Reetz, M. T. (2008). Improved PCR method for the creation of saturation mutagenesis libraries in directed evolution: application to difficult-to-amplify templates. Applied Microbiology and Biotechnology, 81(2), 387–397. http://doi.org/10.1007/s00253-008-1678-9

Sandra T. Merino, J. C. (2007). Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization.

Sowdhamini, R., Srinivasn, N., Shoichet, B., Santi, Daniel, V., Ramakrishnan, C. & Balaram, P. (1989). Stereochemical modeling of disulfide bridges. Criteria for introduction into proteins by site-directed mutagenesis. Protein Engineering.

Span, E. A., & Marletta, M. A. (2015). ScienceDirect The framework of polysaccharide monooxygenase structure and chemistry. Sciencs Direct Current Opinion in Structural Biology, 35, 93–99. http://doi.org/10.1016/j.sbi.2015.10.002

Sukharnikov, L. O., Cantwell, B. J., Podar, M., & Zhulin, I. B. (2011). Cellulases : ambiguous nonhomologous enzymes in a genomic perspective, 1–7. http://doi.org/10.1016/j.tibtech.2011.04.008

Suplatov, D., Voevodin, V., & Švedas, V. (2015). Robust enzyme design: Bioinformatic tools for improved protein stability. Biotechnology Journal, 10(3), 344–355. http://doi.org/10.1002/biot.201400150

Takagi, H., Takahashi, T., & Momose, H. (1990). Enhancement of the Thermostability of Subtilisin E by Introduction a Disulfide Bond Engineered on the Basis of Structural Comparison with a Thermophilic Serine Protease *. Journal of Biological Chemistry, 265(12), 6674–6676.

Tan, T., Kracher, D., Gandini, R., Sygmund, C., Kittl, R., Haltrich, D., … Ha, B. M. (2015). Structural basis for cellobiose dehydrogenase action during oxidative cellulose degradation, (May). http://doi.org/10.1038/ncomms8542

Vaaje-Kolstad, G., Westereng, B., Horn, S. J., Liu, Z., Zhai, H., Sorlie, M., & Eijsink, V. G. H. (2010). An Oxidative Enzyme Boosting the Enzymatic Conversion of Recalcitrant Polysaccharides. Science, 330(6001), 219–222. http://doi.org/10.1126/science.1192231

Vu, V. V, Beeson, W. T., Phillips, C. M., Cate, J. H. D., & Marletta, M. A. (2014). Determinants of Regioselective Hydroxylation in the Fungal Polysaccharide Monooxygenases, 2–5.

Warren, D. J. (2011). Preparation of highly efficient electrocompetent Escherichia coli using glycerol / mannitol density step centrifugation. Analytical Biochemistry, 413(2), 206–207. http://doi.org/10.1016/j.ab.2011.02.036

Wijma, H. J., Floor, R. J., & Janssen, D. B. (2013). Structure- and sequence-analysis inspired engineering of proteins for enhanced thermostability. Current Opinion in Structural Biology, 23(4), 588–594. http://doi.org/10.1016/j.sbi.2013.04.008

Wyman, C. E. (1994). ETHANOL FROM LIGNOCELLULOSIC BIOMASS : TECHNOLOGY , ECONOMICS , AND OPPORTUNITIES, 50.

Xie, Y., An, J., Yang, G., Wu, G., Zhang, Y., Cui, L., & Feng, Y. (2014). Enhanced Enzyme Kinetic Stability by Increasing Rigidity within the Active Site * □, 289(11), 7994–8006. http://doi.org/10.1074/jbc.M113.536045

Yu, X., Tan, N., Xiao, R., & Xu, Y. (2012). Engineering a Disulfide Bond in the Lid Hinge Region of Rhizopus chinensis Lipase : Increased Thermostability and Altered Acyl Chain Length Specificity, 7(10), 1–7. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0046388

Zhang, Y. P., Himmel, M. E., & Mielenz, J. R. (2006). Outlook for cellulase improvement : Screening and selection strategies, 24, 452–481. http://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2006.03.003

Zhang, Y. P., & Lynd, L. R. (2015). Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose : Noncomplexed cellulase systems Toward an Aggregated Understanding of Enzymatic Hydrolysis of Cellulose : Noncomplexed Cellulase Systems, (November). http://doi.org/10.1002/bit.20282

Žifčáková, L., & Baldrian, P. (2012). Fungal polysaccharide monooxygenases: new players in the decomposition of cellulose. Fungal Ecology, 5(5), 481–489. http://doi.org/10.1016/j.funeco.2012.05.001

Universiteit of Hogeschool
Master in de industriële wetenschappen: Biochemie
Publicatiejaar
2016
Promotor(en)
Prof. dr. Tom Desmedt
Kernwoorden
Share this on: