Gerichte evolutie van DNA-polymerase TherminatorTM voor de incorporatie van artificiële nucleotiden met aspartaat als uittredende groep

Eline Berghmans
Van het DNA-polymerase TherminatorTM zijn verschillende varianten (verschillende sequentie) tot stand gebracht. Deze varianten werden geselecteerd op activiteit voor de incorporatie van gemodificeerde nucleotiden met aspartaat als uittredende groep. Dit geniet in de praktijk van een grote belangstelling in de geneeskunde als anti-virale en/of anti-kankercomponenten, maar ook in de biotechnologie omwille van een hogere resistentie tegen degradatie.

XNA, de toekomst voor nieuwe geneesmiddelen?

Bij genetische overerving wordt onmiddellijk het verband gelegd met DNA, dat aanwezig is in de cellen van alle levende wezens. Vandaag de dag onderzoeken synthetische biologen of het mogelijk is om een chemische variant van DNA, in het jargon ook wel XNA genoemd, door zelfgemaakte chemische bouwblokjes in een keten aan elkaar te rijgen. Als dat lukt zou het ook mogelijk moeten zijn om hierin genetische informatie te stoppen die vervat zit in de volgorde van de bouwblokjes, net zoals in DNA. Dergelijke artificiële bouwblokjes, of XNA, komen niet voor in de natuur aangezien er geen levende wezens zijn die over de machinerie (eiwitten, enzymen) beschikken om ze aan te maken of te verdubbelen, laat staan om de erin gecodeerde informatie om te zetten naar bruikbare functies.

Toch heeft XNA mogelijk interessante toepassingen, bijvoorbeeld in de vorm van een nieuw soort geneesmiddel dat de ontwikkeling van kanker en virussen een halt zou kunnen toeroepen door heel gericht te binden aan het DNA van kankercellen of virussen en zo hun werking uit te schakelen. Hiervoor dient een moleculaire machine ontworpen te worden om de artificiële bouwstenen aan elkaar te zetten. Voor de ontwikkeling van zo’n machine is gekozen om de natuurlijke machinerie, die cellen zelf gebruiken, om te bouwen. Het doel is een DNA-polymerase, dat de natuurlijke bouwstenen van DNA aan elkaar kan zetten en zo een nucleïnezuur vormt, te veranderen naar een XNA-polymerase, dat de artificiële bouwstenen aan elkaar kan zetten. In deze thesis hebben we gekozen voor het ombouwen van DNA-polymerase TherminatorTM, een populair polymerase dat erom bekend is het niet zo nauw te nemen en bij het kopiëren van DNA ook wel eens een nepbouwsteen durft te gebruiken. De chemische bouwstenen die wij willen laten inbouwen verschillen van de natuurlijke bouwstenen doordat het pyrofosfaat-gedeelte vervangen is door asparaginezuur. Dat is een natuurlijk voorkomend aminozuur dat niet schadelijk is als het afgesplitst wordt van de rest van de bouwsteen wanneer die door polymerase ingebouwd wordt in een groeiende nucleïnezuurketen. De vraag is hoe we het polymerase zover kunnen krijgen dat het dit snel en met grote precisie doet.

Het uiteindelijk doel is een bacterie XNA zelf te laten aanmaken, wanneer een XNA-polymerase en de artificiële bouwstenen toegediend worden in het laboratorium. Dergelijke bacterie zou dan het DNA niet meer mogen herkennen, laat staan aanmaken. De bacterie zal zo het XNA niet kunnen verspreiden in de natuur, waar tevens ook geen artificiële bouwstenen terug te vinden zijn. Maar zover zijn we echter nog niet.

Er is als startpunt voor dit onderzoek een bibliotheek met miljoenen varianten van het DNA-polymerase TherminatorTM aangemaakt, die allemaal met enkele mutaties van elkaar verschillen. Op die bibliotheek hebben we een ingewikkelde selectie toegepast om die mutanten te vinden die de artificiële nucleotiden beter kunnen inbouwen. Zo kunnen mogelijks XNA-polymerasen ontstaan uit het DNA-polymerase, die in staat zijn de nucleotiden, gekoppeld aan asparaginezuur, in te bouwen. Drie van die mutanten hebben we in detail onderzocht, maar ze bleken slechts weinig verbeterd. De volgende stap zal zijn de verbeterde polymerasen opnieuw te muteren en aan selectie te onderwerpen, en nadien desnoods nog eens. Net wat gebeurt in de natuur: geleidelijke evolutie, maar dan in een proefbuis.

Bibliografie

Adelfinskaya O, Herdewijn P, 2007. Amino Acid Phosphoramidate Nucleotides as Alternative Substrates for HIV-1 Reverse Transcriptase. Angew. Chem. Int. Ed. 46: 4356- 4358.

Adelfinskaya O, Terrazas M, Froeyen M, Marlière P, Nauwelaerts K, Herdewijn P, 2007. Polymerase-catalyzed synthesis of DNA from phosphoramidate conjugates of deoxynucleotides and amino acids. Nucleic Acids Res. 35 (15): 5060-5072.

Berg J, Tymoczko J, Stryer L (2002) – Biochemistry – Fifth Edition. W.H. Freeman, New York, 1050 pp.

Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, Marillonnet S, 2009. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS ONE 4(5).

Delespaul W, Peeters Y, Herdewijn P, Robben J, 2015. A novel helper phage for HaloTag-mediated co-display of enzyme and substrate on phage. Biochemical and Biophysical Research Communications 460: 245-249.

Fa M, Radeghieri A, Henry A, Romesberg F, 2004. Expanding the Substrate Repertoire of a DNA-polymerase by Directed Evolution. J. AM. CHEM. SOC. 126: 1748- 1754.

Garrett R, Grisham C (2009) - Biochemistry - Fifth Edition. Brooks/Cole Publishing Company CENGAGE Learning, Pacific Grove, 1169 pp.

Ghadessy F, Ong J, Holliger P, 2001. Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication. PNAS 98: 4552-4557.

Giraut A, Song XP, Froeyen M, Marlière P, Herdewijn P, 2010. Iminodiacetic- phosphoramidates as metabolic prototypes for diversifying nucleic acid polymerization in vivo. Nucleic Acids Res. 38 (8): 2541-2550.

Herdewijn P, Marlière P, 2009. Toward Safe Genetically Modified Organisms through the Chemical Diversification of Nucleic Acids. Chemistry & Biodiversity 6: 791-807.

Herdewijn P, Marlière P, 2012. Redesigning the leaving group in nucleic acid polymerization. FEBS Letters 586: 2049-2056.

Image removed.

61

Herman BD, Schinazi RF, Zhang H, Nettles JH, Stanton R, Detorio M, Obikhod A, Pradère U, Coats SJ, Mellors JW, Sluis-Cremer N, 2012. Substrate mimicry: HIV-1 reverse transcirptase recognizes 6-modified-3’-azido-2’,3’-dideoxyguanosine-5’-triphosphates as adenosine analogs. Nucleic Acids Res. 40(1): 381-390.

Hübscher U, Spadari S, Villani G, Maga G (2010) – DNA-polymerases – Discovery, Characterization and Functions in cellular DNA Transactions. World Scientific, Singapore, 321 pp.

Ichida JK, Horhota A, Zou K, McLaughlin LW, Szostak JW, 2012. High fidelity TNA synthesis by Therminator polymerase. Nucleic Acids Res. 33 (16): 5219–5225.

Joyce CM, Steitz TA, 1994. Function and structure relationships in DNA- polymerases. Annu Rev Biochem 63: 777-822.

King A, Teertstra W, Van der Vliet P, 1997. Processive proofreading by the adenovirus DNA-polymerase. Association with the priming protein reduces exonucleolytic degradation. Nucleid Acids Res. 25 (9): 1745-1752.

Loakes D, Holliger P, 2009. Polymerase engineering: towards the encoded synthesis of unnatural biopolymers. Chem. Commun. 31: 4619-4631.

Maiti M, Knies C, Dumbre S, Lescrinier E, Rosemeyer H, Ceulemans A, Herdewijn P, 2015. Xylonucleic acid: synthesis, structure, and orthogonal pairing properties. Nucleic Acids Res. 43 (15): 7189-7200.

Pinheiro V, Arangundy-Franklin S, Holliger P, 2014. Compartmentalized Self- Tagging for In Vitro-Directed Evolution of XNA Polymerases. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.

Pinheiro V, Taylor A, Cozens C, Abramov M, Renders M, Zhang S, Chaput J, Wengel J, Peak-Chew S, McLaughlin S, Herdewijn P, Holliger P, 2012. Synthetic Genetic Polymers Capable of Heredity and Evolution. Science 336: 341-344.

Pinheiro V, Taylor A, Cozens C, Abramov M, Renders M, Zhang S, Chaput J, Wengel J, Peak-Chew S, McLaughlin S, Herdewijn P, Holliger P, 2012. Synthetic Genetic Polymers Capable of Heredity and Evolution. Science 336: Supplementary materials (Materials and methods, figures, tables and full reference list).

62

Schmidt M, 2010. Xenobiology: A new form of life as the ultimate biosafety tool. BioEssays 32: 322-331.

Shevelev IV, Hübscher U, 2002. The 3' 5' exonucleases. Nat Rev Mol Cell Biol 3: 364-376.

Steitz TA, 1999. DNA-polymerases: Structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem. 274 (25): 17395-17398.

Tabor S, Richardson C, 1989. Effect of manganese ions on the incorporation of dideoxynucleotides by bacteriophage T7 DNA polymerase and Escherichia coli DNA polymeraseI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4076 – 4080.

Terrazas M, Marlière P, Herdewijn P, 2008. Enzymatically Catalyzed DNA Synthesis using L-Asp-dGMP, L-Asp-dCMP, and L-Asp-dTMP. Chemistry and biodiversity 5: 31-39.

Ussery D, 2002. DNA Structure: A-, B- and Z-DNA Helix Families. Encyclopedia of Life Sciences: 7 pp.

Watson J, Crick F, 1953. Molecular Structure of Nucleic Acids. Nature 171: 737-738. Watt G, 2005. Modified nucleic acids on display. Nature Chemical Biology.

Http://www.nature.com.

Yang S, Herdewijn P, 2011. Polymerase-dependent DNA synthesis from phosphoramidate-activated nucleotides. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 30: 597-608.

Yang S, Froeyen M, Lescrinier E, Marlière P, Herdewijn P, 2011. 3-phosphono-L- alanine as pyrophosphate mimic for DNA synthesis using HIV-1 reverse transcriptase. Org. Biomol. Chem. 9: 11-119.

Yang Z, Sismour M, Benner S, 2007. Nucleoside alpha-thiotriphosphates, polymerases and the exonuclease III analysis of oligonucleotides containing phosphorothioate linkages. Nucleic Acids Res. 35(9): 3118–3127. 

Universiteit of Hogeschool
Biochemie en Biotechnologie
Publicatiejaar
2016
Promotor(en)
Professor Johan Robben
Kernwoorden
Share this on: