Heterologe expressie van het Trypanosoma evansi variabele antigenische glycoproteïne RoTat 1.2 in Leishmania tarentolae

Manon Geerts
Men tracht het variabele antigenische glycoproteïne RoTat 1.2 van T. evansi heteroloog tot expressie te brengen in L. tarentolae voor het maken van een nieuwe serodiagnostische sneltest voor de ziekte surra. Surra heeft een divers gastheerbereik (dieren), komt wereldwijd voor, verspreid zich enorm snel en veroorzaakt grote financiële schade.

Heterologe expressie van het Trypanosoma evansi variabele antigenische glycoproteïne RoTat 1.2 in Leishmania tarentolae voor het maken van een nieuwe serodiagnostische sneltest voor de ziekte surra

ACHTERGROND

Afrikaanse trypanosomiasen zijn verwaarloosde tropische ziektes die armoede handhaven door hun impact op zowel de volksgezondheid als de landbouwproductie. Door hun lage prevalentie en de toxiciteit van de behandeling, is er nood aan eenvoudige, snelle en accurate individuele tests met een hogere gevoeligheid en specificiteit dan de bestaande tests.

Humane Afrikaanse slaapziekte (HAT) of slaapziekte is een parasitaire ziekte veroorzaakt door twee geografisch gescheiden Trypanosoma (T.) brucei (b.) ondersoorten. T.b. gambiense veroorzaakt vooral chronische infecties in West- en Centraal-Afrika, terwijl de meer acute T.b. rhodesiense infecties endemisch zijn in oostelijk en zuidelijk Afrika. De ziekte wordt overgebracht door tseetseevliegen (Glossina species) en komt daardoor enkel voor in sub-Saharisch Afrika, het verspreidingsgebied van de vector.

In tegenstelling tot HAT wordt surra, een infectieziekte veroorzaakt door de protozoaire parasiet T. evansi, mechanisch overgebracht via bijtende insecten (Tabanidae en Stomoxys species) of vampiervleermuizen. Daardoor komt deze ziekte ook voor buiten Afrika, namelijk in het Midden-Oosten, Azië en Zuid- en Centraal-Amerika met zelfs sporadische uitbraken in Europa. Naast de wereldwijde verspreiding en de snelle uitbreiding (door de verplaatsing en de verkoop van veestapel), treft de ziekte een breed spectrum wilde en gedomesticeerde dieren en het veroorzaakt grote financiële schade.

Momenteel wordt de serodiagnose voor surra uitgevoerd via een directe kaartagglutinatietest, namelijk de diagnostische sneltest CATT/T. evansi. Deze antistofdetectietest maakt gebruik van de gevriesdroogde bloedstroomvorm van de trypansoom geïsoleerd uit geïnfecteerde ratten die het predominant variant oppervlakte glycoproteïne (VSG) RoTat 1.2 op hun oppervlakte tot expressie brengen. Maar de productie hiervan is tijdrovend, moeilijk te standaardiseren, duur en vereist het gebruik van proefdieren. Bovendien is er een hoog bioveiligheidsrisico voor het personeel (voornamelijk bij HAT).

Recent is er een nieuwe diagnostische test ontwikkeld, de Surra Sero K-SeT, op basis van een recombinant RoTat 1.2 aangemaakt in Pichia pastoris. Het is een individuele immuno-chromatografische test (ICT) met een laterale flow voor de detectie van specifieke antilichamen tegen het predominante RoTat 1.2 VSG in het bloed van zoogdieren. (Rogé S. , 2015)

METHODEN EN RESULTATEN

In deze bachelorproef werd Leishmania tarentolae gebruikt als eukaryote gastheer in plaats van de gist Pichia pastoris voor de expressie van de recombinante antigenen. Deze parasiet heeft volgende voordelen: eukaryotische proteïnesynthese voor de correcte vouwing van eiwitten, bezit het volledige gamma aan post-translationele aanpassingen, hoge opbrengst van het recombinante eiwit en secretie van het eiwit in het supernatans wat belangrijk is voor de vereenvoudiging van de eiwitzuivering. Bovendien is L. tarentolae makkelijk te manipuleren en goedkoop in cultuur te houden.

Om het RoTat 1.2 VSG tot expressie te brengen hebben we vijf constructen van verschillende lengte en epitopen geselecteerd. De sequenties werden geïntegreerd in de pLEXSY-hyg expressie vector en getransformeerd naar E. coli. Eens de constructen geverifieerd werden via DNA sequencing werd L. tarentolae getransfecteerd. Het secretoom van de getransfecteerde klonen van L. tarentolae werd vervolgens geanalyseerd via SDS-PAGE en immunostaining. Hieruit bleek dat bij één construct alle klonen een aantoonbare expressie vertoonden na immunostaining. Bij een tweede construct bleek slechts één van de drie klonen een aantoonbaar eiwit te produceren. De klonen van drie andere constructen gaven geen aantoonbaar resultaat.

CONCLUSIES EN BETEKENIS

Het construct, dat bestaat uit het volledig N-terminaal gedeelte van het RoTat 1.2 VSG, blijkt tot expressie te komen in het secretoom van Leishmania tarentolae. Het is bovendien gelijkaardig in sequentie als het construct dat in Pichia pastoris reeds succesvol tot expressie kwam. Vooraleer dit antigen in een nieuwe diagnostische sneltest voor surra kan worden geïncorporeerd zijn er echter nog vele verdere stappen in het proces nodig.

Bibliografie

Baral, T. (2010). Immunobiology of African trypanosomes: need of alternative interventions. Journal of Biomedicine and Biotechnology. doi:10.1155/2010/389153

Bargul, J., McOdimba, F. A., Jung, J., Omogo, C. O., Adung'a, V. O., Krüger, T., . . . Engstler, M. (2016). Species-Specific Adaptations of Trypanosome Morphology and Motility to the Mammalian Host. PLoS Patho. doi:10.1371/journal.ppat.1005448

Basile, & Peticca. (2009, november). Recombinant protein expression in Leishmania tarentolae. Mol Biotechnol., 43(3):273-8. doi:10.1007/s12033-009-9213-5

Birhanu H, R. S. (2015). Surra Sero K-SeT, a new immunochromatographic test for serodiagnosis of Trypanosoma evansi infection in domestic animals. Veterinary Parasitology , 211: 153-157.

Birnboim, & Doly. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 1513-23.

Breitling, R., Klingner, S., Callewaert, N., Pietrucha, R., Geyer, A., Ehrlich, G., . . . Alexandrove, K. (2002). Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Academic Press.

Clontech. (2013). In-Fusion HD Cloning. Japan : Takara . Opgehaald van Clontech .

Desquesnes, M., Holzmuller, P., De-Hua, L., Dargantes, A., Lun, Z.-R., & Jittaplapong, S. (2013). Trypanosoma evansi and Surra: A Review and Perspectives on Origin, History, Distribution, Taxonomy, Morphology, Hosts, and Pathogenic Effects. BioMed Research International. doi:10.1155/2013/194176

Eyob, E., & Matios, L. (2013). Review on camel trypanosomosis (surra) due to Trypanosoma evansi: Epidemiology and host response. Journal of Veterinary Medicine and Animal Health, 334-343. doi:10.5897/JVMAH2013.0236

fao. (sd). A field guide for the diagnosis, treatment and prevention of African animal Trypanosomis. Opgeroepen op 02 29, 2016, van Food and Agriculture Organization of the United Nations: http://www.fao.org/docrep/006/x0413e/x0413e02.htm

Hoare, C. (1972). The Trypanosomes of Mammals. A Zoological Monograph. Oxford: Blackwell Scientific Publications .

Maudlin, I., Holmes, P., & Miles, M. (2004). The trypanosomiases . U.K.: CABI Publishing .

Mottram laboratory. (2008). Protocols for handling and working with Leishmania species (Working with Leishmania for Dummies). Opgehaald van University of Glasgow: http://www.gla.ac.uk/media/media_91939_en.pdf

Olsen, O. W. (1986). Animal Parasites: Their Life Cycles and Ecology. New York: Dover Publications Inc. .

Rogé S, B. R. (2014). Development of a latex agglutination test with recombinant variant surface glycoprotein for serodiagnosis of surra. Veterinary Parasitology, 205: 460-465.

Rogé, S. (2015). Development of new serodiagnostic tests for African trypanosomiasis due to Trypanosoma evansi and Trypanosoma brucei gambiense.

Rogé, S., Reet, N. V., Odiwuora, S., Trana, T., Schildermans, K., Vandammec, S., . . . Büscher, P. (2013). Recombinant expression of trypanosome surface glycoproteins in Pichia pastoris for the diagnosis of Trypanosoma evansi infection. Veterinary Parasitology, 197: 571-579.

Rooney, B., Piening, T., Büscher, P., Rogé, S., & Smales, C. M. (2015). Expression of Trypanosoma brucei gambiense Antigens in Leishmania tarentolae. Potential for Use in Rapid Serodiagnostic Tests (RDTs). PLoS Negl Trop Dis 9(12): e0004271. doi:10.1371/journal.pntd.0004271

Sang-Ho, P., Chi-Man, K., Hyung-Eun, K., Hee-jeong, Y., Eung-Chil, C., & Bong-jin, L. (2002). Role of proline, cysteine and a disulphide bridge in the structure and. Biochem. J., 171–182. doi:10.1042/BJ20020385

Schwede, A., Macleod, O. J., MacGregor, P., & Carrington, M. (2015). How does the VSG coat of bloodstream form African Trypanosomes interact with external proteins? . PLoS Pathog 11(12): e1005259. doi:10.1371/journal.ppat.1005259

Songa, E. B., & Hamers, R. (1988). A Card Agglutination Test (CATT) for veterinary use based on an early VAT RoTat 1/2 of Trypanosoma evansi. Annales de la Société Belge de Médecine Tropicale, 233 - 240.

Stephen, L. E. (1986). Trypanosomiasis: a veterinary perspective (1ste ed., Vol. 7: Trypanosoma (Trypanozoon) evansi). Oxford, New York, Bejing, Frankfurt, São Paolo, Sydney, Tokyo, Toronto: Pergamon Press.

Urakawa, T., Verloo, D., Büscher, P., & Majiwa, P. (2001). Cloning and expression in insect cells of the T. evansi RoTat1.2.

Verloo, D., Magnus, E., & Büscher, P. (2001). General expression of RoTat 1.2 variable antigen type in Trypanosoma evansi isolates from different origin. Veterinary Parasitology, 183-189.

Universiteit of Hogeschool
Biomedische laboratoriumtechnologie
Publicatiejaar
2016
Promotor(en)
Prof. Dr. Philippe Büscher en Dr. Nick Van Reet
Kernwoorden
Share this on: