Intra- and interspecies interactions of the BAM-degrading Aminobacter sp. MSH1 in sand filter biofilms under oligotrophic conditions

Hannelore Brocatus
In het drinkwater worden vaak nog micropolluenten, restanten van pesticiden en geneesmiddelen, gedetecteerd en dit met concentraties die hoger zijn dan de limiet van 0.1 µg/L, opgelegd door de EU. De bioaugmentatie van de zandfilters, gebruikt bij drinkwaterproductie, met bacteriën die de micropolluenten kunnen afbreken of mineraliseren zou een duurzame techniek voor het verwijderen van deze micropolluenten kunnen zijn. In deze thesis werd onderzocht of een BAM-afbrekende bacterie een biofilm van zandfilterbacteriën kan binnendringen en kan overleven onder de voedselarme omstandigheden van de biofilm zonder de BAM-degraderende capaciteit te verliezen.

Zijn micro-organismen de toekomst voor het zuiveren van drinkwater?

Zijn micro-organismen de toekomst voor het zuiveren van drinkwater?

“Drinkwater soms niet zo zuiver als gedacht”

Vandaag de dag vinden we het in onze Westerse wereld niet meer dan normaal dat er drinkbaar water uit onze kranen stroomt. Maar is dit drinkwater ook altijd zuiver? Door het grootschalige gebruik van pesticides en geneesmiddelen in onze maatschappij en de ontwikkelijking van nauwkeurigere analytische methodes worden er steeds meer restanten van deze substanties in het drinkwater gedetecteerd. Huidige zuiveringsinstallaties zijn niet ontworpen om dergelijke micropolluenten, substanties die in zeer lage concentraties voorkomen, te verwijderen waardoor ze nog in het drinkwater aangetroffen worden. Welke technieken kunnen ontwikkeld worden om dit probleem aan te pakken? Zijn micro-organismen misschien de toekomst voor het verwijderen van micropolluenten uit het drinkwater?

Huidige zuiveringstechnieken niet voldoende

Door de ontwikkeling van nauwkeurigere analytische methodes werden de laatste jaren gedetailleerdere gegevens verzameld over het drinkwater in Vlaanderen. Hieruit blijkt dat oppervlaktewater en grondwater steeds meer micropolluenten bevatten. Deze polluenten komen vervolgens in het drinkwater terecht in concentraties hoger dan de limiet van 0.1 µg/L, opgelegd door de EU. Op dit moment wordt gebruik gemaakt van granulaire actieve koolfilters om substanties met dergelijke lage concentraties te verwijderen uit het drinkwater. Maar deze techniek is duur en verplaatst de polluent enkel van het water naar de actieve koolfilter in plaats van het effectief af te breken tot CO2 en H2O of andere onschadelijke stoffen. Er is dus vraag naar een duurzamere methode. Hiervoor wordt gekeken naar microbieel gecontroleerde processen aangezien deze meestal duurzamer zijn dan physico-chemische reacties. Voorbeelden van microbieel gecontroleerde processen vinden we zowel terug in de natuurlijke omgeving als bij technische toepassingen. Denk maar aan de microbiële gemeenschap in onze darmen of aan fermentatieprocessen gebruikt voor het brouwen van bier. Wanneer micro-organismen ingezet worden voor het verwijderen van contaminatie, zoals micropolluenten, dan spreken we over bioremediatie.

Bioremediatie

Micro-organismen kunnen het vermogen hebben om polluenten af te breken tot onschadelijke substanties of te mineraliseren tot energie, koolstof (CO2) en nutriënten (N, P, H2O) die de ze kunnen gebruiken voor hun groei. Micro-organismen kunnen dus ingezet worden voor remediatie, het verwijderen van contaminatie. We spreken dan van bioremediatie. We kunnen drie klassen van bioremediatie onderscheiden. Een eerste klasse is het monitoren van natuurlijke afbraak. Hiervoor moeten er intrinsiek al micro-organismen aanwezig zijn op de site die de presente contaminatie kunnen afbreken of transformeren binnen een redelijke tijdspanne. Wanneer de natuurlijke systemen onvoldoende zijn voor een snelle afbraak van de contaminant, kan biostimulatie gebruikt worden. Een voorbeeld van biostimulatie, de tweede klasse van bioremediatie, is het toevoegen van zuurstof onder de watertafel om aerobe processen te bevorderen. Echter, wanneer de micro-organismen die verantwoordelijk zijn voor de degradatie van een doelwitpolluent niet aanwezig zijn op de site wordt gebruik gemaakt van bioaugmentatie. Deze derde klasse van bioremediatie is een biotechnologische toepassing waarbij een polluentdegraderende bacterie geïntroduceerd wordt in vervuilde bodem of water, enz. Het systeem waarin deze bacteriën worden aangebracht bevat reeds een microbiële gemeenschap. Het succes van de bioaugmentatie hangt dus grotendeels af van de mogelijkheid van de geïnjecteerde bacterie om de competitie met de inheemse gemeenschap voor voedingsstoffen en plaats in het systeem te overleven. De selectie van de bacterie voor de bioaugmentatie mag vervolgens niet enkel gebaseerd zijn op de polluentdegradatiecapaciteit van de bacterie maar er moet ook gekeken worden naar de manier waarop de bacterie zal interageren met de bestaande bacteriële gemeenschap.

Bioaugmentatie van zandfilters

Voor het zuiveren van drinkwater wordt vaak gebruik gemaakt van zandfilters. Rond de zandkorrels van deze filters zijn reeds biofilms gevormd van aanwezige bacteriële gemeenschappen. Een biofilm, de meest dominante levensvorm van bacteriën, is een sterk georganiseerde en samenhangende gemeenschap van meestal meerdere microbiële soorten, die zich hechten op een biologisch of inert oppervlak. Deze micro-organismen zijn verankerd in een zelf geproduceerde matrix van extracellulaire polymere substanties. Maar helaas zijn de micro-organismen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak of de mineralisatie van de micropolluenten zelden dominant genoeg aanwezig in de bacteriële gemeenschap van de zandfilters. Bijgevolg kan bioaugmentatie van zandfilters met bacteriestammen die pesticiden en andere micropolluenten kunnen degraderen, een veelbelovende strategie zijn voor het verbeteren van de verwijdering en de afbraak van micropolluenten. Er zijn veel succesvolle voorbeelden gekend van bioaugmentatie in de bodem, maar onderzoek naar het gebruik van bioaugmentatie voor drinkwatertoepassingen is nog zeer gelimiteerd. Er moet onderzocht worden hoe de aangebrachte bacterie gaat interageren met de reeds bestaande biofilm. Zal de bacterie deze biofilm kunnen binnendringen en kunnen overleven in de voedselarme condities van de zandfilter zonder het vermogen om de micropolluent af te breken te verliezen?

 

Afbraakpolluent van dichlobenil in drinkwater

Dichlobenil is een wereldwijd gebruikt herbicide dat vooral gebruikt wordt in particuliere tuinen, in kwekerijen, aan spoorlijnen en snelwegen, enz. Het belangrijkste afbraakproduct van dit herbicide is 2,6-dichloorbenzamide, ook wel BAM genoemd. BAM wordt vaak aangetroffen in het drinkwater met concentraties boven de limiet van 0.1 µg/L, opgelegd door de EU. De bacteriestam Aminobacter sp. MSH1 is in staat om BAM te mineraliseren bij ecologisch relevante concentraties tot onder de grens van 0.1 µg/L, waardoor MSH1 een hoopvolle kandidaat is voor bioaugmentatie van zandfilters van drinkwater zuiveringsinstallaties als een kosteneffectief en duurzaam alternatief voor granulaire actieve kool. Maar het succes van deze bioaugmentatie hangt af van het vermogen van MSH1 om de inheemse bacteriële gemeenschap effectief binnen te dringen en om te overleven in de voedselarme condities van de zandfilter. Om het succes van de bioaugmentatie te kunnen voorspellen is er inzicht nodig in de belangrijkst processen tijdens de overleving van MSH1 wanneer deze de zandfilteromgeving binnen dringt. Zo toonden we aan dat de MSH1 populatie gebruikt voor de bioaugmentatie uit twee subpopulaties bestaat. Een subpopulatie die BAM kan mineraliseren tot CO2  en H2O en een subpopulatie die BAM enkel omzet tot zijn volgend afbraakproduct, 2,6-dichloorbenzoëzuur. Onder de voedselarme condities van de zandfilters zullen de aanwezigheid van AOC en BAM grotendeels bepalen in welke verhouding beide subpopulaties voorkomen. Daarnaast toonden we aan dat MSH1 het best geïnoculeerd kan worden in een zandfilter die al bezet is door een biofilm van een bacteriële zandfiltergemeenschap. Er zal namelijk een coöperatie optreden tussen deze zandfilterbacteriën en MSH1. Ze halen elk hun voordeel uit elkaars aanwezigheid.

Dit onderzoek met de bacteriestam Aminobacter sp. MSH1 op laboschaal heeft ons wat nieuwe inzichten gegeven, maar er zijn hoogstwaarschijnlijk verschillen tussen de resultaten van de proeven uitgevoerd in het labo en de resultaten verkregen uit een zandfilter in een zuiveringsinstallatie te verwachten. Voordat we op de vraag of micro-organismen de toekomst zijn voor het verwijderen van micropolluenten uit het drinkwater kunnen antwoorden, moet er nog heel wat verder onderzoek gedaan worden.

Bibliografie

1.  APEC. The history of clean drinking water. Available from: (1)
 http://www.freedrinkingwater.com/resource-history-of-clean-drinking-wat… 
2.  Swiss Cleanwater Group. History of water (p.3). Available from: (2) http://www.swisscleanwater-group.com/en/history-of-water-p3.html

3.  Aamand J. Biotreatment of drinking water resources polluted by pesticides, pharmaceuticals and
other micropollutants. J Chem Inf Model. 2013;53(9):1689–99.  
4.  Luo Y, Guo W, Ngo HH, Nghiem LD, Hai FI, Zhang J, et al. A review on the occurrence of
micropollutants in the aquatic environment and their fate and removal during wastewater
treatment. Sci Total Environ. 2014;473-474:619–41.  
5.  Verliefde A, Cornelissen E, Amy G, Van der Bruggen B, van Dijk H. Priority organic micropollutants
in water sources in Flanders and the Netherlands and assessment of removal possibilities with
nanofiltration. Environ Pollut. 2007;146(1):281–9.  
6.  Zearley TL, Summers RS. Removal of trace organic micropollutants by drinking water biological
filters. Environ Sci Technol. 2012;46(17):9412–9.  
7.  Cotruvo JA. Organic micropollutants in drinking water: an overview. Sci Total Environ. 1986;47:7–
26.  
8.  Kolpin DW, Skopec M, Meyer MT, Furlong ET, Zaugg SD. Urban contribution of pharmaceuticals
and other organic wastewater contaminants to streams during differing flow conditions. Sci Total
Environ. 2004;328(1-3):119–30.  
9.  Wang C, Shi H, Adams CD, Gamagedara S, Stayton I, Timmons T, et al. Investigation of
pharmaceuticals in Missouri natural and drinking water using high performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry. Water Res [Internet]. Elsevier Ltd;
2011;45(4):1818–28. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.watres.2010.11.043 
10.  Loos R, Locoro G, Comero S, Contini S, Schwesig D, Werres F, et al. Pan-European survey on the
occurrence of selected polar organic persistent pollutants in ground water. Vol. 44, Water
Research. 2010. p. 4115–26.  
11.  Vulliet E, Cren-Olivé C. Screening of pharmaceuticals and hormones at the regional scale, in
surface and groundwaters intended to human consumption. Environ Pollut [Internet]. Elsevier
Ltd; 2011;159(10):2929–34. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.envpol.2011.04.033 
12.  Craun GF. Epidemiologic studies of organic micropollutants in drinking water. Sci Total Environ.
1987;47:461–72.  
13.  The Council of the European Union. Council Directive 98/83/EC of 3 November 1998 on the
quality of water intended for human consumption. Off J Eur Communities. 1998;L330:32–54.  
14.  Younes M, Galal-Gorchev H. Pesticides in drinking water - A case study. Food Chem Toxicol
[Internet]. 2000;38:S87–90. Available from: <Go to ISI>://WOS:000086408400013 
15.  Rasul MT, Jahan MS. Quality of Ground and Surface Water of Rajshahi City Area for Sustainable
Drinking Water Source. J Sci Res [Internet]. 2010;2(3). Available from:
http://www.banglajol.info/index.php/JSR/article/view/4093 
16.  Kim J, Chung Y, Shin D, Kim M, Lee Y, Lim Y, et al. Chlorination by-products in surface water
treatment process. Desalination. 2003;151(1):1–9.  
17.  Neale PA, Antony A, Bartkow ME, Farré MJ, Heitz A, Kristiana I, et al. Bioanalytical assessment of
the formation of disinfection byproducts in a drinking water treatment plant. Environ Sci
Technol. 2012;46(18):10317–25.  
18.  Safe Drinking Water Committee, Hazards B on T an EH, Assembly of Life Sciences. Drinking Water
and Health, Volume 2 [Internet]. Vol. 1904. 1980. Available from:
http://www.nap.edu/catalog.php?record_id=1904 
19.  de Moel PJ, Verberk JQJC, van Dijk JC. Drinking Water: Principles and Practices. 2007;  
20.  Benner J, Helbling DE, Kohler H-PE, Wittebol J, Kaiser E, Prasse C, et al. Is biological treatment a
viable alternative for micropollutant removal in drinking water treatment processes? Water Res.
2013;47(16):5955–76.  
21.  Rueil-Malmaison D. Water treatment handbook. 7th ed. Lavoisier, France; 2007.  
22.  Van der Bruggen B. Waterzuivering en -hergebruik: drinkwaterproductie. Leuven: Acco; 2013.
130 p.  
23.  Balke K-D, Zhu Y. Natural water purification and water management by artificial groundwater
recharge. J Zhejiang Univ Sci B. 2008;9(3):221–6.  
24.  Maeng SK, Ameda E, Sharma SK, Grützmacher G, Amy GL. Organic micropollutant removal from
wastewater effluent-impacted drinking water sources during bank filtration and artificial
recharge. Water Res. 2010;44(14):4003–14.  
25.  Guzzella L, Feretti D, Monarca S. Advanced oxidation and adsorption technologies for organic
micropollutant removal from lake water used as drinking-water supply. Water Res. 2002;36(17):4307–18.

26.  Ormad MP, Miguel N, Claver A, Matesanz JM, Ovelleiro JL. Pesticides removal in the process of
drinking water production. Chemosphere. 2008;71(1):97–106.  
27.  Björklund E, Styrishave B, Anskjær GG, Hansen M, Halling-Sørensen B. Dichlobenil and 2,6dichlorobenzamide
(BAM)
in
the
environment:
What
are
the
risks
to
humans
and
biota?
Sci
Total

Environ.
2011;409(19):3732–9.

28.  Björklund E, Anskjær GG, Hansen M, Styrishave B, Halling-Sørensen B. Analysis and
environmental concentrations of the herbicide dichlobenil and its main metabolite 2,6dichlorobenzamide
(BAM):
A
review.
Sci
Total
Environ.
2011;409(12):2343–56.

29.  Holtze MS, Hansen HCB, Juhler RK, Sørensen J, Aamand J. Microbial degradation pathways of the
herbicide dichlobenil in soils with different history of dichlobenil-exposure. Environ Pollut.
2007;148(1):343–51.  
30.  Reinnicke S, Simonsen A, Sorensen SR, Aamand J, Elsner M. C and N Isotope Fractionation during
Biodegradation of the Pesticide Metabolite 2,6- Dichlorobenzamide (BAM): Potential for
Environmental Assessments. Environ Sci Technol [Internet]. 2011;(i):111216165921008.
Available from: http://dx.doi.org/10.1021/es203660g 
31.  Holtze MS, Sørensen SR, Sørensen J, Aamand J. Microbial degradation of the benzonitrile
herbicides dichlobenil, bromoxynil and ioxynil in soil and subsurface environments - Insights into
degradation pathways, persistent metabolites and involved degrader organisms. Environ Pollut.
2008;154(2):155–68.  
32.  Sørensen SR, Holtze MS, Simonsen A, Aamand J. Degradation and mineralization of nanomolar
concentrations of the herbicide dichlobenil and its persistent metabolite 2,6-dichlorobenzamide
by Aminobacter spp. isolated from dichlobenil-treated soils. Appl Environ Microbiol. 
2007;73(2):399–406.  
33.  Clausen L, Arildskov NP, Larsen F, Aamand J, Albrechtsen HJ. Degradation of the herbicide
dichlobenil and its metabolite BAM in soils and subsurface sediments. J Contam Hydrol.
2007;89(3-4):157–73.  
34.  Vlaamse Milieumaatschappij (VMM). Watermeter 2012. 2012.  
35.  Simonsen A, Badawi N, Anskjær GG, Albers CN, Sørensen SR, Sørensen J, et al. Intermediate
accumulation of metabolites results in a bottleneck for mineralisation of the herbicide
metabolite 2,6-dichlorobenzamide (BAM) by Aminobacter spp. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;94(1):237–45.

36.  Clausen L, Larsen F, Albrechtsen HJ. Sorption of the herbicide dichlobenil and the metabolite 2,6dichlorobenzamide
on
soils
and aquifer
sediments.
Environ
Sci
Technol.
2004;38(17):4510–8.

37.  Vlaamse Milieumaatschappij (VMM). Pesticiden in het grondwater in Vlaanderen. 2012;64.  
38.  Nougadère A, Reninger JC, Volatier JL, Leblanc JC. Chronic dietary risk characterization for
pesticide residues: A ranking and scoring method integrating agricultural uses and food
contamination data. Food Chem Toxicol. 2011;49(7):1484–510.  
39.  De Coster S, van Larebeke N. Adviesvraag : Gezondheidsnormen pesticiden in drinkwater. Luik;
2006.  
40.  T’Syen J, Tassoni R, Hansen L, Sorensen SJ, Leroy B, Sekhar A, et al. Identification of the Amidase
BbdA That Initiates Biodegradation of the Groundwater Micropollutant 2,6-dichlorobenzamide
(BAM) in Aminobacter sp. MSH1. Environ Sci Technol. 2015;49(19):11703–13.  
41.  Lyon DY, Vogel TM, Lyon D, Lyon EC De, Cedex E. Bioaugmentation for Groundwater Remediation
[Internet]. 2013. Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4614-4115-1 
42.  Mitra A, Mukhopadhyay S. Biofilm mediated decontamination of pollutants from the
environment. AIMS Bioeng. 2016;3(1):44–59.  
43.  Niti C, Sunita S, Kamlesh K, Rakesh K. Bioremediation : An emerging technology for remediation
of pesticides B i o r e m e d i a t i o n : A n e m e r g i n g t e c h n o l o g y f o r r e m e d i a t i o n
o f p e s t i c i d e s. 2016;(APRIL 2013).  
44.  Tyagi M, da Fonseca MMR, de Carvalho CCCR. Bioaugmentation and biostimulation strategies to
improve the effectiveness of bioremediation processes. Biodegradation. 2011;22(2):231–41.  
45.  Singh DK. Biodegradation and bioremediation of pesticide in soil: Concept, method and recent
developments. Indian J Microbiol. 2008;48(1):35–40.  
46.  Dueholm MS, Marques IG, Karst SM, D’Imperio S, Tale VP, Lewis D, et al. Survival and activity of
individual bioaugmentation strains. Bioresour Technol. 2015;186:192–9.  
47.  Little AE, Robinson CJ, Peterson SB, Raffa KF, Handelsman J. Rules of Engagement: Interspecies
Interactions that Regulate Microbial Communities. Annu Rev Microbiol [Internet]. 2008;62:375–
401. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&do…
t_uids=18544040

48.  Li YH, Tian X. Quorum sensing and bacterial social interactions in biofilms. Sensors.2012;12(3):2519–38.  

49.  Moons P, Michiels CW, Aertsen A. Bacterial interactions in biofilms. Crit Rev Microbiol [Internet].
2009;35(3):157–68. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19624252 
50.  Romanova YM, Smirnova T, Andreev A, Il’ina T, Didenko L, Gintsburg A. Formation of biofilms as
an example of the social behavior of bacteria. Microbiology [Internet]. 2006;75(4):481–5.
Available from: http://www.springerlink.com/index/10.1134/S0026261706040199 
51.  Utech M, Bruwer M, Nustrat A. Tight Junctions and Cell-Cell Interactions. Methods Mol. Biol.
341. 2006. 185-195 p.  
52.  Flemming H, Wingender J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol [Internet]. Nature Publishing
Group; 2010;8(9):623–33. Available from:
http://dx.doi.org/10.1038/nrmicro2415\nhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20676145 
53.  Albers CN, Feld L, Ellegaard-Jensen L, Aamand J. Degradation of trace concentrations of the
persistent groundwater pollutant 2,6-dichlorobenzamide (BAM) in bioaugmented rapid sand
filters. Water Res [Internet]. 2015;83:61–70. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0043135415300737 
54.  McDowall B, Hoefel D, Newcombe G, Saint CP, Ho L. Enhancing the biofiltration of geosmin by
seeding sand filter columns with a consortium of geosmin-degrading bacteria. Water Res
[Internet]. Elsevier Ltd; 2009;43(2):433–40. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.watres.2008.10.044 
55.  Krüger US, Johnsen AR, Burmølle M, Aamand J, Sørensen SR. The potential for bioaugmentation
of sand filter materials from waterworks using bacterial cultures degrading 4-chloro-2methylphenoxyacetic
acid.
Pest
Manag
Sci.
2015;71(2):257–65.

56.  Bradford SM, Palmer CJ, Olson BH. Assimilable Organic-Carbon Concentrations in Southern
California Surface and Groundwater. Water Res. 1994;28(2):427–35.  
57.  Albers CN, Jacobsen OS, Aamand J. Using 2,6-dichlorobenzamide (BAM) degrading Aminobacter
sp. MSH1 in flow through biofilters - Initial adhesion and BAM degradation potentials. Appl
Microbiol Biotechnol. 2014;98(2):957–67.  
58.  Richard A, Louise PH. SAC review “ Omic ” technologies : proteomics and metabolomics Learning
objectives : Ethical issues : Obstet Gynaecol. 2011;13(1):189–95.  
59.  Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet
[Internet]. 2009;10(1):57–63. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19015660 

60.  Vermeulen CJ, Sørensen P, Kirilova Gagalova K, Loeschcke V. Transcriptomic analysis of
inbreeding depression in cold-sensitive Drosophila melanogaster shows upregulation of the
immune response. J Evol Biol. 2013;26(9):1890–902.  
61.  Lo AW, Seers C a, Boyce JD, Dashper SG, Slakeski N, Lissel JP, et al. Comparative transcriptomic
analysis of Porphyromonas gingivalis biofilm and planktonic cells. BMC Microbiol [Internet].
2009;9:18. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2637884&tool=…
rtype=abstract 
62.  Zlosnik JEA, Speert DP. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia
cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J Infect Dis [Internet].
2010;202(5):770–81. Available from: http://jid.oxfordjournals.org/lookup/doi/10.1086/655663 
63.  Yung TW, Jonnalagadda S, Balagurunathan B, Zhao H. Transcriptomic Analysis of 3Hydroxypropanoic

Acid Stress in Escherichia coli. Appl Biochem Biotechnol [Internet].
2016;178(3):527–43. Available from: http://link.springer.com/10.1007/s12010-015-1892-8 
64.  Jeon YJ, Xun Z, Su P, Rogers PL. Genome-wide transcriptomic analysis of a flocculent strain of
Zymomonas mobilis. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;93(6):2513–8.  
65.  Vera JC, Wheat CW, Fescemyer HW, Frilander MJ, Crawford DL, Hanski I, et al. Rapid
transcriptome characterization for a nonmodel organism using 454 pyrosequencing. Mol Ecol.
2008;17(7):1636–47.  
66.  Kochling T, Sanz JL, Gavazza S, Florencio L. Analysis of microbial community structure and
composition in leachates from a young landfill by 454 pyrosequencing. Appl Microbiol
Biotechnol. 2015;99(13):5657–68.  
67.  Blaalid R, Carlsen T, Kumar S, Halvorsen R, Ugland KI, Fontana G, et al. Changes in the root-
114
 
associated fungal communities along a primary succession gradient analysed by 454 
pyrosequencing. Mol Ecol. 2012;21(8):1897–908.  
68.  Carvalhais V, Franca A, Cerca F, Vitorino R, Pier GB, Vilanova M, et al. Dormancy within
Staphylococcus epidermidis biofilms: A transcriptomic analysis by RNA-seq. Appl Microbiol
Biotechnol. 2014;98(6):2585–96.  
69.  Hermans K, Nguyen TLA, Roberfroid S, Schoofs G, Verhoeven T, De Coster D, et al. Gene
expression analysis of monospecies Salmonella Typhimurium biofilms using Differential
Fluorescence Induction. J Microbiol Methods. 2011;84(3):467–78. 

70.  Schneider WP, Ho SK, Christine J, Yao M, Marra A, Hromockyj AE. Virulence gene identification
by differential fluorescence induction analysis of Staphylococcus aureus gene expression during
infection-simulating culture. Infect Immun. 2002;70(3):1326–33.  
71.  Rediers H, Rainey PB, Vanderleyden J. Unraveling the secret lives of bacteria: use of in vivo
expression technology and differential fluorescence induction promoter traps as tools for
exploring Niche-specific gene expression. Microbiol Mol Biol Rev. 2005;69(2):217–61.  
72.  Allaway D, Schofield NA, Mary E, Gilardoni L, Finan TM, Poole PS. Use of differential fluorescence
induction and optical trapping to isolate environmentally induced genes. 2001;3.  
73.  Marra A, Asundi J, Bartilson M, Lawson S, Fang F, Christine J, et al. Differential fluorescence
induction analysis of Streptococcus pneumoniae identifies genes involved in pathogenesis. Infect
Immun [Internet]. 2002;70(3):1422–33. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=127766&tool=p…
ype=abstract 
74.  Karunakaran R, Mauchline TH, Hosie AHF, Poole PS. A family of promoter probe vectors
incorporating autofluorescent and chromogenic reporter proteins for studying gene expression
in Gram-negative bacteria. Microbiology. 2005;151(10):3249–56.  
75.  Bartilson M, Marra A, Christine J, Asundi JS, Schneider WP, Hromockyj AE. Differential
fluorescence induction reveals Streptococcus pneumoniae loci regulated by competence
stimulatory peptide. Mol Microbiol. 2001;39(1):126–35.  
76.  Irie Y, Parsek MR. Pseudomonas Methods and Protocols: Transposon Mutagenesis (chapter 39).
Pseudomonas Methods Protoc [Internet]. 2014;1149:271–9. Available from:
http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-0473-0 
77.  Lewenza S, Falsafi RK, Winsor G, Gooderham WJ, Mcphee JB, Brinkman FSL, et al. Construction 
of a mini-Tn 5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1 : A tool for identifying 
differentially regulated genes. Genome Res. 2005;583–9.  
78.  Langridge GC, Phan MD, Turner DJ, Perkins TT, Parts L, Haase J, et al. Simultaneous assay of every
Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Res. 2009;19(12):2308–
16.  
79.  Lopez I. Random Transposon Mutagenesis Used to Identify Pigmentation Gene in
Chromobacterium violaceum. 2012;1–10.  
80.  Lyell NL, Dunn AK, Bose JL, Vescovi SL, Stabb E V. Effective mutagenesis of Vibrio fischeri by using hyperactive mini-Tn5 derivatives. Appl Environ Microbiol. 2008;74(22):7059–63. 

81.  Sekhar A, Horemans B, Aamand J, Sorensen SR, Vanhaeke L, Vanden Bussche J, et al. Surface
colonization and activity of the 2, 6-dichlorobenzamide (BAM) degrading Aminobacter sp. strain
MSH1 at macropollutant and micropollutant BAM concentrations.  
82.  Lorenzo VDE, Herrero M, Jakubzik UTE. Mini-TnS Transposon Derivatives for Insertion
Mutagenesis , Promoter Probing , and Chromosomal Insertion of Cloned DNA in Gram-Negative
Eubacteria. Notes. 1990;172(11):6568–72.  
83.  Raes B, Horemans B, Springael D. Moleculaire merkers ter verbetering van de bioaugmentatie
van zandfilters voor drinkwater productie. Catholic University of Leuven; 2015.  
84.  Khalayi NR, Horemans B, Springael D. Transposan mutagenesis for “Social” gene identification in
Aminobacter sp. MSH1 used for bioaugmentation of sand filters in the drinking water production
process. Catholic University of Leuven; 2015.  
85.  Tolker-Nielsen T, Sternberg C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. In: Current
Protocols in Microbiology. John Wiley & Sons, Inc.; 2005.  
86.  Tolker-Nielsen T, Sternberg C. Methods for Studying Biofilm Formation: Flow Cells and Confocal
Laser Scanning Microscopy. In: Ramos AF and JL, editor. in Pseudomonas: Methods and
Protocols. 2014. p. p. 615–29.  
87.  Klindworth  et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and
next-generation sequencing-based diversity studies. 2013;  
88.  Kozich JJ, Westcott SL, Baxter NT, Highlander SK, Schloss PD. Development of a dual-index
sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq
Illumina sequencing platform. Appl Environ Microbiol. 2013;79(17).  
89.  Yanti, Horemans B, Springael D. Biodegradatie van de grondwater contaminant 2,6dichlorobenzamide

(BAM) in een bioaugmentatie pilootexperiment voor productie van
drinkwater. Catolic University of Leuven; 2015.  
90.  Horemans B, Albers P, Springael D. The Biofilm Concept from a Bioremediation Perspective. In:
Lear G, editor. Biofilms in Bioremediation. Auckland; 2016. p. p23–40.  

Universiteit of Hogeschool
Bio-ingenieurswetenschappen Milieutechnologie
Publicatiejaar
2016
Promotor(en)
Dirk Springael, Benjamin Horemans
Kernwoorden
Share this on: