Extracellulaire vesicles als kanker biomerkers, kan het?

Winde
Hilven

Kanker is een ernstige ziekte waar iedereen al wel mee in aanraking gekomen is, direct of indirect. Deze ziekte heeft een grote impact op patiënten maar ook op familieleden en vrienden. Binnen mijn thesis onderzoek werd er gefocust op de detectie optimaliseren van een gen mutatie die therapieën slecht of onwerkbaar maakt. Zo werd dus verdiept op de bruikbaarheid van een niet invasieve staal collectie methode voor mutatie opvolging in patiënten.

Mutaties opsporen in longkankers bij patiënten gebeurt momenteel door weefselbiopten af te nemen. Deze methode is invasief en garandeert niet dat er een representatieve diagnose voor de gehele tumor wordt waargenomen. Een niet-invasief alternatief zijn vloeibare biopsieën. Hiermee kunnen celvrij tumor-DNA en circulerende tumorcellen geanalyseerd worden in biologische vloeistoffen zoals het bloed. Deze zijn echter aanwezig in latere stadia van de ziekte. Daarom is er grote belangstelling voor merkers die in een vroeg stadium van kanker beschikbaar zijn, zoals extracellulaire vesicles (EVs). Deze vesicles komen vrij in de bloedbaan voor cel communicatie en bevatten dezelfde mutaties als de kankercellen waarvan ze afkomstig zijn. Het zijn een soort van pakketjes die de cel waarvan ze afkomstig zijn representeren. Deze pakketjes bevatten een dubbele membraan structuur die hun inhoud beschermt tegen kapotgaan en zo dus interessant zijn voor DNA mutatie opvolging.

Afbeelding1 3

In dit eindwerk wordt een methoden geoptimaliseerd om de mutatiedetectie te verbeteren van de puntmutatie T790M in het epidermale groeifactor receptor (EGFR) gen in extracellulaire vesicles afkomstig van de menselijke NCI-H1975 longkankercellijn.

De invloed van twee verschillende bloedafnamebuisjes op de EV-concentratie in het bloed, de totale hoeveelheid proteïnen en de aanwezigheid van EV-gerelateerde proteïnemerkers werd geëvalueerd. De gebruikte RNA Complete bloedafnamebuisjes waren het best geschikt voor EV-stabilisatie. Dit is dan ook waar te nemen in onderstaande grafiek (bijgevoegde grafiek 1). CD9 en CD81 zijn proteïnen die veelvoorkomend in extracellulaire vesicles hun membranen. De populatie die deze merker bevat ligt hoger binnen het gebruikte RNA complete bloedcollectie buisje. Dit zou dus beter zijn om te gebruiken in klinische toepassingen voor EV-stabilisatie, afgewogen met wat het gewenste doel is van de EVs.

Afbeelding2 9

Bovendien werd bio-laaginterferometrie geoptimaliseerd voor EV-binding met NCI-H1975 cellijn afgeleide EVs die de EGFR T790M mutatie bevatten. Er werd een duidelijk negatief signaal geproduceerd door EV-binding. De conformatie van EV-binding gebeurde met behulp van een gouden nanodeeltjes sandwich essay, het verloop hiervan kan je zien aan de hand van enkele tekeningen.

Afbeelding3 5

Afbeelding4 4

Een groter bindingssignaal verscheen bij gebruik van het anti-EV-geassocieerd proteïne CD81 antilichaam in vergelijking met het bindingssignaal van EVs bij gebruik van het anti-CD9 antilichaam. Onderzoek van de gevangen EVs gebeurden met Digitale PCR om de aanwezigheid van EGFR T790M aan te tonen. Een correlatie tussen de hoeveelheid mutaties en de gebruikte hoeveelheid EVs kon niet teruggevonden worden binnen deze proefopstellingen Dit kan verklaard worden door de aanwezigheid van vrije DNA-fragmenten die een signaal en mutatie hoeveelheid verstorende werking kunnen hebben.

Afbeelding5 1

Wel was er een duidelijk signaal verschil tussen te zien op de real time bio-laaginterferometrie data tussen het gebruiken van antilichamen met of zonder EVs aanwezig. Het is dus mogelijk om EVs met deze techniek te vangen.

Dit project gaf inzicht in de bruikbaarheid van EVs voor het opsporen van kankermutaties en mogelijkheden om toekomstige EV-gebaseerde moleculaire diagnostiek te verbeteren. Verdere evaluatie van een groter aantal bloedstalen en variaties tussen verschillende plasma monsters is nodig voor concrete conclusies. Wel is het al zeker, extracellulaire vesicles bieden grootse mogelijkheden voor toekomstige diagnosticering.

Bibliografie

Abels, E. R., & Breakefield, X. O. (2016). Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol, 36(3), 301- 312. https://doi.org/10.1007/s10571-016-0366-z AlQahtani, S. H., AlOgaiel, A. M., AlMosa, K. N., Alenazi, S. H., AlHasan, M. K., AlObaidan, R. H. et al. (2021). Frequency of Epidermal Growth Factor Receptor and T790M Mutations Among Patients With Non-Small Cell Lung Carcinoma: A Hospital-Based Study in the King Khalid University Hospital (KKUH) Since 2009-2017. Cureus, 13(11), e19816. https://doi.org/10.7759/cureus.19816 Belgische Federale Overheidsdiensten (2021). Daling van het aandeel hart- en vaatziekten als belangrijkste doodsoorzaak in 2018. Statbel. Retrieved 14 March from https://statbel.fgov.be/nl/themas/bevolking/sterfte-enlevensverwachting/doodsoorzaken#news Bio-Rad. (2022). Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad Laboratories, Inc. Retrieved 17 February from https://www.biorad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf Biotechnologie, P. (2022). Instructions Micro BCA Protein Assay Kit. Thermo Fisher. Retrieved 1 May from https://www.thermofisher.com/document-connect/documentconnect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFSAssets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011237_Micro_BCA_Protein_Asy_UG.pdf Bray, F., Ferlay, J., Soerjomataram, I., Siegel, R. L., Torre, L. A., & Jemal, A. (2018). Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 68(6), 394-424. https://doi.org/10.3322/caac.21492 Chin, A. R., & Wang, S. E. (2016). Cancer-derived extracellular vesicles: the 'soil conditioner' in breast cancer metastasis? Cancer Metastasis Rev, 35(4), 669-676. https://doi.org/10.1007/s10555-016-9639-8 Das, B. R., Bhaumik, S., Ahmad, F., Mandsaurwala, A., & Satam, H. (2015). Molecular spectrum of somatic EGFR and KRAS gene mutations in non small cell lung carcinoma: determination of frequency, distribution pattern and identification of novel variations in Indian patients. Pathol Oncol Res, 21(3), 675-687. https://doi.org/10.1007/s12253-014- 9874-7 Doyle, L. M., & Wang, M. Z. (2019). Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells, 8(7), 727. https://doi.org/10.3390/cells8070727 El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., & Wood, M. J. (2013). Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov, 12(5), 347-357. https://doi.org/10.1038/nrd3978 Holcar, M., Kanduser, M., & Lenassi, M. (2021). Blood Nanoparticles - Influence on Extracellular Vesicle Isolation and Characterization [Review]. Front Pharmacol, 12, 773844. https://doi.org/10.3389/fphar.2021.773844 Hur, J. Y., Kim, H. J., Lee, J. S., Choi, C. M., Lee, J. C., Jung, M. K. et al. (2018). Extracellular vesicle-derived DNA for performing EGFR genotyping of NSCLC patients. Mol Cancer, 17(1), 15. https://doi.org/10.1186/s12943-018-0772-6 Interactions, C. f. M. (2022). Biolayer Interferometry (BLI). Harvard Medical School. Retrieved 15 February from https://cmi.hms.harvard.edu/biolayer-interferometry IZON siences (2022). qEVoriginal user manual. IZON Science LTD. Retrieved 26 April from https://www.schaefer-tec.it/sites/default/files/qEVoriginal_Technical_N… Jacobs, A. (2021). Standard Operating Procedure Kinetic assay on octet K2. In. VITO. Kim, H. J., Rames, M. J., Tassi Yunga, S., Armstrong, R., Morita, M., Ngo, A. T. P. et al. (2022). Irreversible alteration of extracellular vesicle and cell-free messenger RNA profiles in human plasma associated with blood processing and storage. Sci Rep, 12(1), 2099. https://doi.org/10.1038/s41598-022-06088-9 45 Lacroix, R., Judicone, C., Mooberry, M., Boucekine, M., Key, N. S., Dignat-George, F. et al. (2013). Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. J Thromb Haemost, 11(6), 1190-1193. https://doi.org/10.1111/jth.12207 Lai, W. Y., Chen, C. Y., Yang, S. C., Wu, J. Y., Chang, C. J., Yang, P. C. et al. (2014). Overcoming EGFR T790M-based Tyrosine Kinase Inhibitor Resistance with an Allelespecific DNAzyme. Mol Ther Nucleic Acids, 3, e150. https://doi.org/10.1038/mtna.2014.3 Lotvall, J., Hill, A. F., Hochberg, F., Buzas, E. I., Di Vizio, D., Gardiner, C. et al. (2014). Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles, 3(Issue 1), 26913. https://doi.org/10.3402/jev.v3.26913 Lu, X., Yu, L., Zhang, Z., Ren, X., Smaill, J. B., & Ding, K. (2018). Targeting EGFR(L858R/T790M) and EGFR(L858R/T790M/C797S) resistance mutations in NSCLC: Current developments in medicinal chemistry. Med Res Rev, 38(5), 1550- 1581. https://doi.org/10.1002/med.21488 Neven, K. Y., Nawrot, T. S., & Bollati, V. (2017). Extracellular Vesicles: How the External and Internal Environment Can Shape Cell-To-Cell Communication. Curr Environ Health Rep, 4(1), 30-37. https://doi.org/10.1007/s40572-017-0130-7 Nicholson, R. I., Gee, J. M., & Harper, M. E. (2001). EGFR and cancer prognosis. Eur J Cancer, 37 Suppl 4, S9-15. https://doi.org/10.1016/s0959-8049(01)00231-3 Palviainen, M., Saraswat, M., Varga, Z., Kitka, D., Neuvonen, M., Puhka, M. et al. (2020). Extracellular vesicles from human plasma and serum are carriers of extravesicular cargo-Implications for biomarker discovery. PLoS One, 15(8), e0236439. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0236439 Punnoose, E. A., Atwal, S., Liu, W., Raja, R., Fine, B. M., Hughes, B. G. et al. (2012). Evaluation of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in non-small cell lung cancer: association with clinical endpoints in a phase II clinical trial of pertuzumab and erlotinib. Clin Cancer Res, 18(8), 2391-2401. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR11-3148 Ricordel, C., Friboulet, L., Facchinetti, F., & Soria, J. C. (2018). Molecular mechanisms of acquired resistance to third-generation EGFR-TKIs in EGFR T790M-mutant lung cancer. Ann Oncol, 29(suppl_1), i28-i37. https://doi.org/10.1093/annonc/mdx705 Schubert, A., & Boutros, M. (2021). Extracellular vesicles and oncogenic signaling. Mol Oncol, 15(1), 3-26. https://doi.org/10.1002/1878-0261.12855 Smart SEC System (2022). SmartSEC® HT EV Isolation System for Serum & Plasma user manual. System Biosciences, LLC. Retrieved 28 April from https://www.systembio.com/products/exosome-research/exosomeisolation/smartsec/smartsec-ht-ev-isolation-system-for-serum-plasma Song, H. N., Jung, K. S., Yoo, K. H., Cho, J., Lee, J. Y., Lim, S. H. et al. (2016). Acquired C797S Mutation upon Treatment with a T790M-Specific Third-Generation EGFR Inhibitor (HM61713) in Non-Small Cell Lung Cancer. J Thorac Oncol, 11(4), e45-47. https://doi.org/10.1016/j.jtho.2015.12.093 Spalding, K., Bonnier, F., Bruno, C., Blasco, H., Board, R., Benz-de Bretagne, I. et al. (2018). Enabling quantification of protein concentration in human serum biopsies using attenuated total reflectance - Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy. Vibrational Spectroscopy, 99, 50-58. https://doi.org/10.1016/j.vibspec.2018.08.019 Stevanato, F., Paolini, R., Fabris, F., Casonato, A., & Cella, G. (1990). Effect of cellulose acetate 0.2 micron filter on platelet specific proteins plasma levels. Folia Haematol Int Mag Klin Morphol Blutforsch, 117(3), 377-381. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1703106 Thakur, B. K., Zhang, H., Becker, A., Matei, I., Huang, Y., Costa-Silva, B. et al. (2014). Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Res, 24(6), 766-769. https://doi.org/10.1038/cr.2014.44 46 Thery, C., Witwer, K. W., Aikawa, E., Alcaraz, M. J., Anderson, J. D., Andriantsitohaina, R. et al. (2018). Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles, 7(1), 1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018.1535750 Tian, Y., Gong, M., Hu, Y., Liu, H., Zhang, W., Zhang, M. et al. (2020). Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. J Extracell Vesicles, 9(1), 1697028. https://doi.org/10.1080/20013078.2019.1697028 Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., & Chen, Z. (2017). Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cell Physiol Biochem, 43(4), 1718-1730. https://doi.org/10.1159/000484035 Travis, W. D., Brambilla, E., Noguchi, M., Nicholson, A. G., Geisinger, K., Yatabe, Y. et al. (2013). Diagnosis of lung cancer in small biopsies and cytology: implications of the 2011 International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society classification. Arch Pathol Lab Med, 137(5), 668-684. https://doi.org/10.5858/arpa.2012-0263-RA Tsatsaronis, J. A., Franch-Arroyo, S., Resch, U., & Charpentier, E. (2018). Extracellular Vesicle RNA: A Universal Mediator of Microbial Communication? Trends Microbiol, 26(5), 401-410. https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.02.009 van Niel, G., D'Angelo, G., & Raposo, G. (2018). Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol, 19(4), 213-228. https://doi.org/10.1038/nrm.2017.125 Wallner, J., Sissolak, B., Sommeregger, W., Lingg, N., Striedner, G., & Vorauer-Uhl, K. (2019). Lectin bio-layer interferometry for assessing product quality of Fc- glycosylated immunoglobulin G. Biotechnol Prog, 35(5), e2864. https://doi.org/10.1002/btpr.2864 Walter, A. O., Sjin, R. T., Haringsma, H. J., Ohashi, K., Sun, J., Lee, K. et al. (2013). Discovery of a mutant-selective covalent inhibitor of EGFR that overcomes T790Mmediated resistance in NSCLC. Cancer Discov, 3(12), 1404-1415. https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-13-0314 Wan, Y., Liu, B., Lei, H., Zhang, B., Wang, Y., Huang, H. et al. (2018). Nanoscale extracellular vesicle-derived DNA is superior to circulating cell-free DNA for mutation detection in early-stage non-small-cell lung cancer. Ann Oncol, 29(12), 2379-2383. https://doi.org/10.1093/annonc/mdy458 Wang, X., Liu, H., Shen, Y., Li, W., Chen, Y., & Wang, H. (2018). Low-dose computed tomography (LDCT) versus other cancer screenings in early diagnosis of lung cancer: A meta-analysis. Medicine (Baltimore), 97(27), e11233. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000011233 Yanez-Mo, M., Siljander, P. R., Andreu, Z., Zavec, A. B., Borras, F. E., Buzas, E. I. et al. (2015). Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles, 4(1), 27066. https://doi.org/10.3402/jev.v4.27066 Yuan, G., Xie, H., Wei, T., Zhu, D., Zhang, C., & Yang, Y. (2021). Diagnostic potential of extracellular vesicle-associated microRNA-10b and tumor markers for lung adenocarcinoma. Oncol Lett, 22(2), 614. https://doi.org/10.3892/ol.2021.12875 Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., & Lai, C. P. (2015). Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. BioScience, 65(8), 783- 797. https://doi.org/10.1093/biosci/biv084 Zhang, Z., Stiegler, A. L., Boggon, T. J., Kobayashi, S., & Halmos, B. (2010). EGFR-mutated lung cancer: a paradigm of molecular oncology. Oncotarget, 1(7), 497-514. https://doi.org/10.18632/oncotarget.186

Download scriptie (2.98 MB)
Universiteit of Hogeschool
Thomas More Hogeschool
Thesis jaar
2022
Promotor(en)
Nelissen Inge, Van Hoof Rebekka, Sabine Van Miert