WETENSCHAPPERS BOEKEN DOORBRAAK IN OPSPORING VAN CLOSTRIDIUM BOTULINUM, ' S WERELDS GEVAARLIJKSTE VOEDSELPATHOGEEN
Wetenschappers Boeken Doorbraak in Opsporing van Clostridium botulinum, 's Werelds Gevaarlijkste Voedselpathogeen
Chehrazad Rahouti
In een baanbrekend onderzoek zijn wetenschappers er recent in geslaagd om belangrijke verbeteringen aan te brengen in de methoden voor het isoleren en karakteriseren van Clostridium botulinum (C. botulinum), de bacterie die verantwoordelijk is voor het dodelijke botulisme. Deze ontwikkelingen kunnen een cruciale rol spelen in de preventie van voedselgerelateerde uitbraken en dragen bij aan een betere bescherming van de volksgezondheid.
C. botulinum: De Bacterie die Botox Maakt en Botulisme Veroorzaakt
C. botulinum is een bacterie die in de microbiologische wereld bekend staat als een van de meest gevreesde pathogenen. Dit komt door de productie van botulinumtoxine (BoNT), een van de krachtigste gifstoffen die de mensheid kent. Dit toxine, bekend van de cosmetische toepassing als Botox, kan ernstige spierverlammingen veroorzaken en is zelfs dodelijk in zeer kleine hoeveelheden. Hoewel botulisme relatief zeldzaam is, zijn de gevolgen ervan zo ernstig dat elk geval een groot risico vormt voor de volksgezondheid.
De sporen van C. botulinum zijn alomtegenwoordig in de natuur en zijn buitengewoon resistent tegen extreme omgevingsomstandigheden, zoals hitte en droogte. Deze sporen kunnen echter uitgroeien tot toxineproducerende bacteriën wanneer ze zich in zuurstofarme omgevingen bevinden, zoals in vacuümverpakt of ingeblikt voedsel, of in gerookte vleeswaren. Dit maakt de bacterie een serieuze bedreiging, vooral in de voedingsindustrie.
Uitdagingen bij Isolatie en Karakterisatie
Ondanks de gevaren die C. botulinum met zich meebrengt, is het isoleren van de bacterie uit besmette monsters een uiterst complexe en tijdrovende taak. Dit komt doordat de bacterie onder normale omstandigheden moeilijk te kweken is en er momenteel geen optimaal selectief medium beschikbaar is om de bacterie te onderscheiden van andere micro-organismen. Dit maakt de detectie van C. botulinum afhankelijk van gespecialiseerde laboratoria en zeer specifieke methoden.
Het recent voltooide onderzoek, uitgevoerd in samenwerking met het Nationaal Referentiecentrum (NRC), Sciensano, richtte zich op het verbeteren van deze methoden. Het doel was om een protocol te optimaliseren die het mogelijk maken om C. botulinum efficiënter te isoleren en te karakteriseren, zodat laboratoria sneller en nauwkeuriger kunnen reageren op mogelijke uitbraken.
Tweefasenaanpak voor Verbeterde Isolatie
Het onderzoek was opgebouwd in twee delen. Het eerste deel richtte zich op het isoleren van C. botulinum uit verschillende soorten monsters, zoals voedselproducten en fecesstalen, die eerder positief waren getest op de aanwezigheid van de bacterie. Hierbij werd een tweefasenaanpak gehanteerd: een methode zonder selectie van resistente sporen en een methode met selectie van deze sporen.
Beide methoden begonnen met het vernieuwen van oude verrijkingsculturen, waarin de bacterie mogelijk aanwezig was, in een vers medium. Vervolgens werden de culturen geïncubeerd, waarna DNA werd geëxtraheerd en een PCR-test werd uitgevoerd om de aanwezigheid van het botulinumtoxine-gen te bevestigen.
In de methode met sporenselectie werd een extra stap toegevoegd om de meest resistente sporen van C. botulinum te selecteren. Dit werd bereikt door de culturen te behandelen met hitte of ethanol, waardoor alleen de sporen overbleven die de behandeling konden overleven. De culturen werden vervolgens geïnoculeerd op EYA-platen, waar de bacteriën die lipase produceren (een kenmerk van C. botulinum) visueel konden worden geïdentificeerd door een regenboogachtige schijn rond de kolonies (Figuur 1).
Figuur 1. C. botulinum op EYA-plaat waarbij glanzende laag (A), regenboogstructuur (B), of lichtere zone rond de kolonie (C) waarneembaar zijn.
De geselecteerde kolonies werden opnieuw onderworpen aan PCR-tests om de aanwezigheid van het botulinumtoxine-gen te bevestigen. Indien de stam zuiver was en het gen positief testte, werd de stam toegevoegd aan de stammencollectie van het NRC. Dit proces stelde de onderzoekers in staat om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor de isolatie van C. botulinum, zelfs uit complexe en verontreinigde monsters.
Optimalisatie van DNA-extractie en Kweekomstandigheden
Het tweede deel van het onderzoek richtte zich op het optimaliseren van de kweek- en DNA-extractieparameters om DNA van hoge kwaliteit te verkrijgen voor whole-genome sequencing (WGS). Dit was essentieel om de genetische samenstelling van C. botulinum te kunnen analyseren en zo beter te begrijpen hoe verschillende stammen zich ontwikkelen en verspreiden. De onderzoekers testten verschillende variabelen, zoals het type groeimedium, de incubatietijd, het extractievolume en de concentratie van lysozyme (een enzym dat bacteriële celwanden afbreekt om zo het DNA vrij te laten). Het doel was om de beste omstandigheden te vinden voor de groei van C. botulinum en voor de extractie van zuiver en geconcentreerd DNA.
TPGY-groeimedium leverde de hoogste DNA-opbrengst met een incubatietijd van 24 uur. Een extractievolume van 1,5 ml en een lysozymeconcentratie van 100 mg/ml resulteerden in de beste DNA-opbrengst en minder contaminatie. De DNA-kwaliteit werd beoordeeld met Nanodrop, Quantus™ en PFGE; hoewel PFGE verder geoptimaliseerd moet worden, gaven de andere technieken bruikbare resultaten. De DNA-extracten werden gebruikt voor short-read (Illumina) en long-read sequencing (MinION), wat waardevolle genetische informatie opleverde.
Succes en Toekomstige Uitdagingen
De onderzoekers slaagden erin C. botulinum succesvol te isoleren in 10 van de 11 geteste verrijkingsculturen met de geoptimaliseerde workflow (Figuur 2). Het protocol maakt isolatie van de bacterie uit zowel menselijke als voedingsstalen mogelijk. Het isoleren van de bacterie is cruciaal voor verdere karakterisatie, omdat het toelaat om het genetisch materiaal van de bacterie zonder contaminanten te verkrijgen. Dit materiaal kan vervolgens worden bestudeerd voor een volledige karakterisatie. Daarnaast stelt het laboratoria in staat om een link te leggen tussen de besmettingsbron (voeding) en de getroffen patiënten, wat essentieel is voor het onderzoek naar uitbraken.
Figuur 2.Geoptimiseerde workflow voor de isolatie van C. botulinum.
Hoewel het onderzoek vooruitgang boekt, blijft de optimalisatie van de PFGE-techniek een uitdaging. Verbeterde isolatiemethoden en een beter begrip van C. botulinum kunnen botulisme-uitbraken helpen begrijpen en misschien zelfs helpen voorkomen in de toekomst. Effectieve isolatie- en DNA-extractieprotocollen zijn essentieel voor een goed gekarakteriseerde stammencollectie en het traceren van voedselgerelateerde uitbraken.
Conclusie
Onderzoek naar C. botulinum heeft geleid tot aanzienlijke verbeteringen in isolatie-, kweek- en analysemethoden. Het geoptimaliseerde protocol versnelt en versterkt de reactie op potentiële botulisme-uitbraken, wat bijdraagt aan voedselveiligheid en volksgezondheid. Hoewel er nog werk aan de winkel is, markeert deze doorbraak een belangrijke stap in de voortdurende strijd tegen een van de meest gevreesde voedselpathogenen ter wereld.
Bibliografie
Anses. (2010). Clostridium botulinum, and neurotoxigenic Clostridia. Geraadpleegd op 15 januari 2024, https://www.anses.fr/en/system/files/MIC2010sa0234FiEN.pdf;
Arnon, S. S., Schechter, R., Inglesby, T. V., Henderson, D. A., Bartlett, J. G., Ascher, M. S., Eitzen, E., Fine, A. D., Hauer, J., Layton, M., Lillibridge, S., Osterholm, M. T., O'Toole, T., Parker, G., Perl, T. M., Russell, P. K., Swerdlow, D. L., Tonat, K., & Working Group on Civilian Biodefense (2001). Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. JAMA, 285(8), 1059–1070. https://doi.org/10.1001/jama.285.8.1059;
Berntsen, M., Bøgevig, S., Høgberg, L. C. G., & Barnung, S. K. (2022). Ugeskrift for laeger, 184(7), V07210574. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35179113/;
Biologielessen. (z.d.). Neurotoxinen. Geraadpleegd op 25 januari 2024, https://biologielessen.nl/index.php/a-9/1893-botuline-2;
Bonventre, P. F., & Kempe, L. L. (1960). Physiology of toxin production by Clostridium botulinum types A and B. IV. Activation of the toxin. Journal of bacteriology, 79(1), 24–32. https://doi.org/10.1128/jb.79.1.24-32.1960;
Chatham-Stephens, K., Fleck-Derderian, S., Johnson, S. D., Sobel, J., Rao, A. K., & Meaney-Delman, D. (2017). Clinical Features of Foodborne and Wound Botulism: A Systematic Review of the Literature, 1932-2015. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 66(suppl_1), S11–S16. https://doi.org/10.1093/cid/cix811;
Chen, F., Chen, H., Chen, Y., Wei, W., Sun, Y., Zhang, L., Cui, L., & Wang, Y. (2021). Dysfunction of the SNARE complex in neurological and psychiatric disorders. Pharmacological Research, 165, 105469. https://doi.org/10.1016/J.PHRS.2021.105469;
Chertow, D. S., Tan, E. T., Maslanka, S. E., Schulte, J., Bresnitz, E. A., Weisman, R. S., Bernstein, J., Marcus, S. M., Kumar, S., Malecki, J., Sobel, J., & Braden, C. R. (2006). Botulism in 4 adults following cosmetic injections with an unlicensed, highly concentrated botulinum preparation. JAMA, 296(20), 2476–2479. https://doi.org/10.1001/jama.296.20.2476;
Craik, C. S., Page, M. J., Madison, E. L. (2011). Proteases as therapeutics. The Biochemical journal. 435. 1-16. 10.1042/BJ20100965. https://www.researchgate.net/publication/50398117_Proteases_as_therapeu…;
Critchley, E. M. (1991). A comparison of human and animal botulism: a review. Journal of the Royal Society of Medicine, 84(5), 295–298. https://doi.org/10.1177/014107689108400516;
Crowner, B. E., Brunstrom, J. E., & Racette, B. A. (2007). Iatrogenic botulism due to therapeutic botulinum toxin a injection in a pediatric patient. Clinical neuropharmacology, 30(5), 310–313. https://doi.org/10.1097/WNF.0b013e31804b1a0d;
Davis, L. E. (1993). Botulinum toxin. From poison to medicine. The Western journal of medicine, 158(1), 25–29. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8470380/;
Dong, Y. P., Wang, W., Jiang, T., Xu, J., Han, C. H., Yan, S. F., Fanning, S., Li, Y., Ma, X. C., Zhang, D., Zhao, Y., Zeng, B., & Li, F. Q. (2017). Molecular and Epidemiological Characterization of Infant Botulism in Beijing, China. Biomedical and environmental sciences : BES, 30(6), 460–464. https://doi.org/10.3967/bes2017.061;
Duff, J. T., Wright, G. G., & Yarinsky, A. (1956). Activation of Clostridium botulinum type E toxin by trypsin. Journal of bacteriology, 72(4), 455–460. https://doi.org/10.1128/jb.72.4.455-460.1956;
Fankhauserblog. (1997). Bacteria on prepared slides. Lab protocols – Lectures Notes. Geraadpleegd op 20 februari 2024, https://fankhauserblog.wordpress.com/1997/07/
Felske-Zech, H., Edler, K. S., Martytschan, I., Gruber, C., & Heidorn, F. (n.d.). The Maxwell® Low Elution Volume System for Forensic Casework: Routine Use in a Forensic Laboratory. Department of Legal Medicine, Division Forensic DNA Services, Justus-Liebig University, Giessen, Germany. https://www.promega.jp/-/media/files/resources/conference-proceedings/i…;
Fortier, L. C. (2017). The Contribution of Bacteriophages to the Biology and Virulence of Pathogenic Clostridia. Advances in applied microbiology, 101, 169–200. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2017.05.002;
Gilligan P.H., Brown L., Berman R.E. (1983). Differentiation of Clostridium difficile Toxin from Clostridium botulinum Toxin by the Mouse Lethality Test. Appl Environ Microbiol45. https://doi.org/10.1128/aem.45.1.347-349.1983;
Grenda, T., Kukier, E., & Kwiatek, K. (2014). Methods and difficulties in detection of Clostridium botulinum and its toxins. Polish journal of veterinary sciences, 17(1), 195–205. https://doi.org/10.2478/pjvs-2014-0029;
Griffin, P. M., Hatheway, C. L., Rosenbaum, R. B., & Sokolow, R. (1997). Endogenous antibody production to botulinum toxin in an adult with intestinal colonization botulism and underlying Crohn's disease. The Journal of infectious diseases, 175(3), 633–637. https://doi.org/10.1093/infdis/175.3.633;
Illumina.com. (z.d.). Deeper insights into complex regions of the genome - Long-read sequencing helps resolve challenging regions of the genome. https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/long-read-sequencing.html#:~:text=While%20short%20reads%20can%20capture,in%20areas%20like%20genetic%20disease;
Jeffery, I. A., & Karim, S. (2023). Botulism. In StatPearls. StatPearls Publishing. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29083673/;
Johnson, E.A. (1999). Clostridium – Clostridium botulinum. Encyclopedia of food microbiology, 458-463. https://doi.org/10.1006/rwfm.1999.0395;
Johnston, R., Harmon, S., & Kautter, D. (1964). METHOD TO FACILITATE THE ISOLATION OF CLOSTRIDIUM BOTULINUM TYPE E. Journal of bacteriology, 88(5), 1521–1522. https://doi.org/10.1128/jb.88.5.1521-1522.1964;
Kalka-Moll, W. M., Aurbach, U., Schaumann, R., Schwarz, R., & Seifert, H. (2007). Wound botulism in injection drug users. Emerging infectious diseases, 13(6), 942–943. https://doi.org/10.3201/eid1306.061336;
Koetsier, G., & Cantor, E. (z.d.). A Practical Guide to Analyzing Nucleic Acid Concentration and Purity with Microvolume Spectrophotometers. https://www.neb.com/en/-/media/nebus/files/application-notes/technote_m…;
Lagueny, A., & Burbaud, P. (1996). Mécanisme d’action, indication et résultats des traitements par la toxine botulinique. Neurophysiologie Clinique/Clinical Neurophysiology, 26(4), 216–226. https://doi.org/10.1016/S0987-7053(96)85003-9;
Le Gratiet, T., Poezevara, T., Rouxel, S., Houard, E., Mazuet, C., Chemaly, M., & Maréchal, C. L. (2020). Development of An Innovative and Quick Method for the Isolation of Clostridium botulinum Strains Involved in Avian Botulism Outbreaks. Toxins, 12(1), 42. https://doi.org/10.3390/toxins12010042;
Le Maréchal, C., Hulin, O., Macé, S., Chuzeville, C., Rouxel, S., Poëzevara, T., Mazuet, C., Pozet, F., Sellal, E., Martin, L., Viry, A., Rubbens, C., & Chemaly, M. (2019). A Case Report of a Botulism Outbreak in Beef Cattle Due to the Contamination of Wheat by a Roaming Cat Carcass: From the Suspicion to the Management of the Outbreak. Animals : an open access journal from MDPI, 9(12), 1025. https://doi.org/10.3390/ani9121025;
Lindström, M., & Korkeala, H. (2006). Laboratory diagnostics of botulism. Clinical microbiology reviews, 19(2), 298–314. https://doi.org/10.1128/CMR.19.2.298-314.2006;
Lonati, D., Schicchi, A., Crevani, M., Buscaglia, E., Scaravaggi, G., Maida, F., Cirronis, M., Petrolini, V. M., & Locatelli, C. A. (2020). Foodborne Botulism: Clinical Diagnosis and Medical Treatment. Toxins, 12(8), 509. https://doi.org/10.3390/toxins12080509;
López-Otín, C., & Bond, J. S. (2008). Proteases: multifunctional enzymes in life and disease. The Journal of biological chemistry, 283(45), 30433–30437. https://doi.org/10.1074/jbc.R800035200;
Lynt, R. K., Kautter, D. A., & Solomon, H. M. (1982). Differences and Similarities Among Proteolytic and Nonproteolytic Strains of Clostridium botulinum Types A, B, E and F: A Review. Journal of food protection, 45(5), 466–474. https://doi.org/10.4315/0362-028X-45.5.466;
McCroskey, L. M., Hatheway, C. L., Fenicia, L., Pasolini, B., & Aureli, P. (1986). Characterization of an organism that produces type E botulinal toxin but which resembles Clostridium butyricum from the feces of an infant with type E botulism. Journal of clinical microbiology, 23(1), 201–202. https://doi.org/10.1128/jcm.23.1.201-202.1986;
McCroskey, L. M., & Hatheway, C. L. (1988). Laboratory findings in four cases of adult botulism suggest colonization of the intestinal tract. Journal of clinical microbiology, 26(5), 1052–1054. https://doi.org/10.1128/jcm.26.5.1052-1054.1988;
Michigan State University. (z.d.). Research Technology Support Facility – Oxford Nanopore Sample Requirements. https://rtsf.natsci.msu.edu/genomics/sample-requirements/oxford-nanopore-sample-requirements.aspx#:~:text=DNA%20should%20have%20a%20260,DNA%20sample%20is%20truly%20pure;
Microbenotes. (2023). Lecithinase Test (Nagler’s Reaction): Principle, Procedure, Results. Geraadpleegd op 27 februari 2024, https://microbenotes.com/lecithinase-test-objectives-principle-procedur…;
Nakamura, K., Kohda, T., Shibata, Y., Tsukamoto, K., Arimitsu, H., Hayashi, M., Mukamoto, M., Sasakawa, N., & Kozaki, S. (2012). Unique biological activity of botulinum D/C mosaic neurotoxin in murine species. Infection and immunity, 80(8), 2886–2893. https://doi.org/10.1128/IAI.00302-12;
National Center for Infectious Diseases (U.S.), Division of Bacterial and Mycotic Diseases. (1998). Botulism Santin the United States, 1899-1996; handbook for epidemiologists, clinicians, and laboratory workers. Geraadpleegd op 16 januari 2024, https://www.cdc.gov/botulism/pdf/bot-manual.pdf;
National Institute of Justice. (2023). DNA Extraction and Quantitation for Forensic Analysts – Chelex® 100 Extraction Process. Geraadpleegd op 1 maart 2024, https://nij.ojp.gov/nij-hosted-online-training-courses/dna-extraction-a…;
Ni, S. A., & Brady, M. F. (2023). Botulism Antitoxin. In StatPearls. StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK534807/#article-37505.s3;
Oxford Nanopore Technologies. (z.d.). Flushing a MinION/GridION Flow Cell. Geraadpleegd op 9 mei 2024, https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/…;
Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., Mac Kenzie, W. R., & Vugia, D. J. (1998). Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. JAMA, 279(11), 859–863. https://doi.org/10.1001/jama.279.11.859;
Paul, P., Rajput, S., Joshi, P., Naithani, M., Chowdhury, N., Rao, S., & Pai, M. O. (2021). Comparison of Fluorometric and UV Spectrophotometric Findings for DNA Isolated From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Blocks, Fine Needle Aspiration Cytology Smears, and Blood. Cureus, 13(11), e19583. https://doi.org/10.7759/cureus.19583;
Payne, J. R., Khouri, J. M., Jewell, N. P., & Arnon, S. S. (2018). Efficacy of Human Botulism Immune Globulin for the Treatment of Infant Botulism: The First 12 Years Post Licensure. The Journal of Pediatrics, 193, 172–177. https://doi.org/10.1016/J.JPEDS.2017.10.035;
Peck, M.W. (2009). Biology and genomic analysis of Clostridium botulinum. Advances in microbial physiology, 55, 183–320. https://doi.org/10.1016/S0065-2911(09)05503-9;
Popoff, M.R. (2005). Clostridium botulinum – Institut Pasteur. https://phototheque.pasteur.fr/fr/asset/fullTextSearch/WS/HOME_MENU/nod…;
Promega. (z.d.). Quantus™ Fluorometer and NGS Starter Package. https://be.promega.com/products/microplate-readers-fluorometers-luminometers/fluorometers/quantus-fluorometer/?catNum=E6150;
Rao, A. K., Sobel, J., Chatham-Stephens, K., & Luquez, C. (2021). Clinical Guidelines for Diagnosis and Treatment of Botulism, 2021. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports, 70(2), 1–30. https://doi.org/10.15585/mmwr.rr7002a1;
Rasetti-Escargueil, C., Lemichez, E., & Popoff, M. R. (2019). Public health risk associated with botulism as foodborne zoonoses. Toxins, 12(1). https://doi.org/10.3390/TOXINS12010017;
Rawson, A. M., Dempster, A. W., Humphreys, C. M., & Minton, N. P. (2023). Pathogenicity and virulence of Clostridium botulinum. Virulence, 14(1), 2205251. https://doi.org/10.1080/21505594.2023.2205251;
Sakaguchi, Y., Hayashi, T., Kurokawa, K., Nakayama, K., Oshima, K., Fujinaga, Y., Ohnishi, M., Ohtsubo, E., Hattori, M., & Oguma, K. (2005). The genome sequence of Clostridium botulinum type C neurotoxin-converting phage and the molecular mechanisms of unstable lysogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(48), 17472–17477. https://doi.org/10.1073/pnas.0505503102;
Sante Publique France. (2023). Cas de botulisme alimentaire à Bordeaux : 15 cas recensés, dont 10 hospitalisés et 1 décès. Point de situation au 14 septembre 2023. Geraadpleegd op 25 februari 2024, https://www.santepubliquefrance.fr/les-actualites/2023/cas-de-botulisme….;
Sciensano. (z.d.). Botulisme. Geraadpleegd op 14 januari 2024, https://www.sciensano.be/nl/gezondheidsonderwerpen/botulisme;
Simpson L. (2013). The life history of a botulinum toxin molecule. Toxicon : official journal of the International Society on Toxinology, 68, 40–59. https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2013.02.014;
Skarin, H., Håfström, T., Westerberg, J., & Segerman, B. (2011). Clostridium botulinum group III: a group with dual identity shaped by plasmids, phages and mobile elements. BMC genomics, 12, 185. https://doi.org/10.1186/1471-2164-12-185;
Sobel, J., Tucker, N., Sulka, A., McLaughlin, J., & Maslanka, S. (2004). Foodborne botulism in the United States, 1990-2000. Emerging infectious diseases, 10(9), 1606–1611. https://doi.org/10.3201/eid1009.030745;
Sobel, J. (2005). Botulism. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 41(8), 1167–1173. https://doi.org/10.1086/444507;
Spika, J. S., Shaffer, N., Hargrett-Bean, N., Collin, S., MacDonald, K. L., & Blake, P. A. (1989). Risk factors for infant botulism in the United States. American journal of diseases of children (1960), 143(7), 828–832. https://doi.org/10.1001/archpedi.1989.02150190078026;
Srivathsan, A., Lee, L., Katoh, K., Hartop, E., Narayanan Kutty, S., Wong, J., Yeo, D., Meier, R.. (2021). ONTbarcoder and MinION barcodes aid biodiversity discovery and identification by everyone, for everyone. BMC Biol 19, 217 (2021). https://doi.org/10.1186/s12915-021-01141-x;
Synbio Technologies. (z.d.). Precision and Accuracy with TaqMan Probes. https://synbio-tech.com/precision-and-accuracy-with-taqman-probes/;
The Center for Food Security & Public Health (2018). Botulisme. The Center for Food Security & Public Health. https://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/botulism.pdf;
ThermoFisher Scientific. (z.d.). Real-Time PCR basics - How TaqMan assays work. https://www.thermofisher.com/be/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/…;
Tjaberg T. B. (1974). Proteases of Clostridium botulinum. VI. The role of trypsin, Clostridium botulinum proteases and protease inhibitors in the formation and activation of toxin in growing cultures of Clostridium botulinum. Acta veterinaria Scandinavica, 15(4), 487–506. https://doi.org/10.1186/BF03547221;
Van Waes, D. (2015). Botulisme bij hond en kat. https://libstore.ugent.be/fulltxt/RUG01/002/216/089/RUG01-002216089_201…;
Walewski, V. (2019). Clostridium botulinum. https://www.sfm-microbiologie.org/wp-content/uploads/2019/07/BACTERIE_C…;
World Health Organisation. (2023). World Health Organisation – Botulism. Geraadpleegd op 29 januari 2024, https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/botulism;
World Health Organisation. (2023). World Health Organisation – Iatrogenic botulism – European region. Geraadpleegd op 25 februari 2024, https://www.who.int/emergencies/disease-outbreak-news/item/2023-DON450#…;
Zariquiey-Esteva, G., Galeote-Cózar, D., Santa-Candela, P., & Castanera-Duro, A. (2018). Botulism in the ICU: Nursing care plan. Botulismo en la UCI: proceso de cuidados. Enfermeria intensiva, 29(2), 86–93. https://doi.org/10.1016/j.enfi.2017.07.003.
