De jacht op kanker: het opsporen van cruciale eiwitmodificaties
Kanker is een verwoestende ziekte die miljoenen levens ontwricht. Wat als de oplossing verborgen ligt in onze eigen cellen? In dit onderzoek gaan we op zoek naar eiwitten en hun subtiele aanpassingen —post-translationele modificaties (PTMs)— die nauw verbonden zijn met kanker. Met behulp van geavanceerde zuiveringstechnieken en nauwkeurige detectiemethoden proberen we deze cruciale veranderingen exact te lokaliseren, omdat deze kleine verschillen het lot van een cel kunnen bepalen—gezond of kwaadaardig.
Verstoring in de balans
Ons DNA geeft de instructies voor het maken van eiwitten, maar soms gaat hier iets mis. Aanpassingen kunnen de delicate balans in ons lichaam verstoren, waarbij bepaalde stukken DNA het zwijgen wordt opgelegd, terwijl andere delen onnodig worden afgelezen en omgezet tot eiwitten. Verschillende types van die aanpassingen – PTMs of post-translationele modificaties genoemd – zijn typerend voor bepaalde kankers wanneer ze op specifieke plaatsen worden teruggevonden. Deze trachten we tijdens dit onderzoek te lokaliseren.
Rollen maar!
DNA vormt de genetische code die omgezet wordt tot eiwitten, maar niet alle eiwitten zijn op elk moment nodig. Om dit te regelen, wordt DNA opgerold rond eiwitten, histonen genaamd, die samen nucleosomen vormen. Stel je DNA voor als een lange ketting met parels, waarbij de nucleosomen de parels zijn die de ketting opkrullen tot een compacte structuur. Dit voorkomt dat het DNA constant actief is en regelt de productie van eiwitten.
PTMs
Op histonen kunnen chemische structuren (de PTM) worden toegevoegd. De soort PTM kan bepalen of dat stuk DNA opgerold of ontvouwen wordt, wat de eiwitproductie beïnvloedt. Wij onderzoeken zo’n 12 verschillende types, maar elk histon tussen het DNA is op meerdere plaatsen vatbaar voor de aanpassingen. Dit zorgt dus voor ontiegelijk veel mogelijke combinaties om te bestuderen. We maakten in samenspraak met partnerinstellingen een selectie van 66 peptides of interest, die aan de oorzaak van bepaalde soorten kankers liggen.
Peptides of what?
Om histonen te onderzoeken, worden die eerst kleiner geknipt tot peptide fragmenten. Eiwitten worden geknipt met een enzym, in dit geval ArgC-Ultra. Als het histon PTMs bevat, zullen deze nog steeds aanwezig zijn op de gefragmenteerde peptiden ervan. In de gigantische berg van verkregen data wordt gezocht naar de op voorhand bepaalde selectie fragmenten, ook wel de peptides of interest genoemd.
Naast het fragmenteren van de histonen, doorloopt het staal verschillende voorbereidende stappen. Het doel van het onderzoek is namelijk om een methode te optimaliseren die een zo zuiver mogelijk staal oplevert. Uiteraard hopen we hierdoor zo veel mogelijk peptides of interest in het staal te kunnen detecteren. We maken gebruik van cellen die afkomstig zijn van de OPM-2 kankercellijn.
Optimalisatie
Verschillende zuiveringsstappen worden uitgevoerd: het staal wordt eerst gewassen met een nuclei isolation buffer, daarna gecentrifugeerd en vervolgens verder gezuiverd door de binding van de vrijgekomen histonen met magnetische parels.
Als optimalisatie wordt een extra opzuiveringsstap toegevoegd voor de histonen worden gefragmenteerd. De extra zuiveringsstap maakt gebruik van een cartridge, dat is een soort tip met een plug aan het uiteinde. De plug functioneert als een filter waarop het staal wordt aangebracht. De histonen komen makkelijk los wanneer er een acetonitriloplossing over stroomt, terwijl de resterende onzuiverheden en zouten in de plug achterblijven.
Na de fragmentatie wordt het staal geanalyseerd met de RPLC - tandem MS met trapped ion mobility. Dit zijn een combinatie van analytische technieken die ervoor zorgen dat de componenten in het staal zoveel mogelijk gescheiden worden om ze vervolgens te kunnen identificeren.
Onze bevindingen
De extra zuiveringsstap leidt tot een aanzienlijke verbetering in zuiverheid, met histonen als de meest voorkomende eiwitten in het staal.
Uiteindelijk konden we 9 van de 66 gezochte peptiden detecteren. Mogelijk zijn er nog 27 peptides of interest aanwezig. Dit wil zeggen dat we deze 27 peptiden op de juiste positie hebben geïdentificeerd, maar dat hun verwachte PTMs nog ontbraken. Om deze peptiden mét PTMs te detecteren kan het zinvol zijn de methode van de analysetoestellen verder te verfijnen.
Voor de peptiden die niet in het staal zijn gedetecteerd, kunnen aanpassingen in de staalvoorbereiding nodig zijn. Daarnaast kan overwogen worden om een geheel nieuwe staalvoorbereidingsmethode te ontwikkelen.
De jacht gaat verder
Bij toekomstig onderzoek is het belangrijk dat de focus blijft liggen op het nauwkeurig detecteren en lokaliseren van kanker gerelateerde PTMs en het verbeteren van de detectiemethoden. Deze verbeterde methoden kunnen de deur openen naar revolutionaire gentherapieën die gericht zijn op het aanpassen van deze specifieke eiwitmodificaties. Hoewel de resultaten veelbelovend zijn, moeten we goed nadenken over hoe deze modificaties de werking van eiwitten beïnvloeden en de mogelijke bijwerkingen van dergelijke ingrepen.
Het zijn vaak de kleinste veranderingen die de grootste impact hebben. Post-translationele modificaties op eiwitten, hoewel minuscuul in omvang, kunnen levensveranderende inzichten opleveren. Door deze subtiele eiwitmodificaties te ontrafelen, leggen we de fundamenten voor potentieel baanbrekende therapieën. Dit kan zelfs het begin betekenen van een nieuw tijdperk in de strijd tegen kanker.
Bibliografie
Arnaud, C. (2020, May 22). Ion mobility-mass spec. https://cen.acs.org/analytical-chemistry/mass-spectrometry/Resolving-po…
Audagnotto, M., & Dal Peraro, M. (2017). Protein post-translational modifications: In silico prediction tools and molecular modeling. Computational and Structural Biotechnology Journal, 15, 307–319. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2017.03.004
Audia, J. E., & Campbell, R. M. (2016). Histone Modifications and Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 8(4), a019521. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a019521
Battellino, T., Ogata, K., Spicer, V., Ishihama, Y., & Krokhin, O. (2023). Acetic Acid Ion Pairing Additive for Reversed-Phase HPLC Improves Detection Sensitivity in Bottom-up Proteomics Compared to Formic Acid. Journal of Proteome Research, 22(1), 272–278. https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.2c00388
Ben. (2018, May 24). News in Proteomics Research: EvoSep. News in Proteomics Research. https://proteomicsnews.blogspot.com/2018/05/new-biorxiv-paper-shows-how…
Chen, L., Liu, S., & Tao, Y. (2020). Regulating tumor suppressor genes: Post-translational modifications. Signal Transduction and Targeted Therapy, 5, 90. https://doi.org/10.1038/s41392-020-0196-9
Core principles of Mass Spectrometry. (n.d.). Retrieved 17 May 2024, from https://www.shimadzu.com/an/service-support/technical-support/analysis-…
Electrospray Ionization (ESI). (n.d.). Retrieved 16 May 2024, from https://www.shimadzu.com/an/service-support/technical-support/analysis-…
Evosep guide. (2023, January 19). LabRulez LCMS. https://lcms.labrulez.com/webinar/2317
Evotips: Disposable trap columns reduce overhead time between samples. (n.d.). Retrieved 18 April 2024, from https://www.evosep.com/evotip/
Guilhaus, M. (2005). MASS SPECTROMETRY | Time-of-Flight. In P. Worsfold, A. Townshend, & C. Poole (Eds.), Encyclopedia of Analytical Science (Second Edition) (pp. 412–423). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B0-12-369397-7/00347-2
Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., & Krijgsveld, J. (2019). Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols, 14(1), 68–85. https://doi.org/10.1038/s41596-018-0082-x
Katagiri, S., Yonezawa, T., Kuyama, J., Kanayama, Y., Tamakl, T., Ohnishi, M., Tarui, S., Nishida, K., & Abe, T. (1985). Two distinct human myeloma cell lines originating from one patient with myeloma. International Journal of Cancer, 36(2), 241–246. https://doi.org/10.1002/ijc.2910360217
Keppler, B., & Archer, T. (2008). Chromatin-modifying enzymes as therapeutic targets—Part 1. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 12, 1301–1312. https://doi.org/10.1517/14728222.12.10.1301
Krasny, L., & H. Huang, P. (2021). Data-independent acquisition mass spectrometry (DIA-MS) for proteomic applications in oncology. Molecular Omics, 17(1), 29–42. https://doi.org/10.1039/D0MO00072H
Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., & Jenuwein, T. (2001). Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature, 410(6824), 116–120. https://doi.org/10.1038/35065132
Mariño-Ramírez, L., Kann, M. G., Shoemaker, B. A., & Landsman, D. (2005). Histone structure and nucleosome stability. Expert Review of Proteomics, 2(5), 719–729. https://doi.org/10.1586/14789450.2.5.719
Morrison, O., & Thakur, J. (2021). Molecular Complexes at Euchromatin, Heterochromatin and Centromeric Chromatin. International Journal of Molecular Sciences, 22(13), 6922. https://doi.org/10.3390/ijms22136922
Nitsch, S., Zorro Shahidian, L., & Schneider, R. (2021). Histone acylations and chromatin dynamics: Concepts, challenges, and links to metabolism. EMBO Reports, 22(7), e52774. https://doi.org/10.15252/embr.202152774
Noberini, R., Restellini, C., Savoia, E. O., & Bonaldi, T. (2020). Enrichment of histones from patient samples for mass spectrometry-based analysis of post-translational modifications. Methods (San Diego, Calif.), 184, 19–28. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2019.10.001
Noberini, R., Robusti, G., & Bonaldi, T. (2022). Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: Applications, progress, and challenges. The FEBS Journal, 289(5), 1191–1213. https://doi.org/10.1111/febs.15707
Oncogene. (2024, May 29). https://www.genome.gov/genetics-glossary/Oncogene
Plateforme—EN | PPC. (2019). https://ppc-montpellier.com/index.php/plateforme-en/
Plazas-Mayorca, M. D., Zee, B. M., Young, N. L., Fingerman, I. M., LeRoy, G., Briggs, S. D., & Garcia, B. A. (2009). One-Pot Shotgun Quantitative Mass Spectrometry Characterization of Histones. Journal of Proteome Research, 8(11), 5367–5374. https://doi.org/10.1021/pr900777e
Prudent, M., & Girault, H. H. (2009). Functional electrospray emitters. Analyst, 134(11), 2189–2203. https://doi.org/10.1039/B910917J
Quadrupole mass analyzer principle, limits, benefits and applications. (n.d.). Retrieved 17 May 2024, from https://www.nandantechnicals.com/2021/05/quadrupole-mass-analyzer-princ…
Rittiner, J. E., Cumaran, M., Malhotra, S., & Kantor, B. (2022). Therapeutic modulation of gene expression in the disease state: Treatment strategies and approaches for the development of next-generation of the epigenetic drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. https://www.semanticscholar.org/paper/Therapeutic-modulation-of-gene-ex…
Römpp, A., & Spengler, B. (2013). Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochemistry and Cell Biology, 139(6), 759–783. https://doi.org/10.1007/s00418-013-1097-6
Shanmugam, M. K., Arfuso, F., Arumugam, S., Chinnathambi, A., Jinsong, B., Warrier, S., Wang, L. Z., Kumar, A. P., Ahn, K. S., Sethi, G., & Lakshmanan, M. (2018). Role of novel histone modifications in cancer. Oncotarget, 9(13), 11414–11426. https://doi.org/10.18632/oncotarget.23356
Sidoli, S., & Garcia, B. A. (2017). Characterization of Individual Histone Posttranslational Modifications and Their Combinatorial Patterns by Mass Spectrometry-Based Proteomics Strategies. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1528, 121–148. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6630-1_8
Sinha, A., & Mann, M. (2020). A beginner’s guide to mass spectrometry–based proteomics. The Biochemist, 42. https://doi.org/10.1042/BIO20200057
Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2007). Principles of instrumental analysis (Sixth edition). Thomson Brooks/Cole. http://catdir.loc.gov/catdir/enhancements/fy1302/2006926952-t.html
Stein, R., & Riber, L. (2023). Epigenetic Effects of Short-Chain Fatty Acids from the Large Intestine on Host Cells. microLife, 4. https://doi.org/10.1093/femsml/uqad032
The cell. (2024). https://www.amboss.com/us/knowledge/the-cell
Torres, I. O., & Fujimori, D. G. (2015). Functional coupling between writers, erasers and readers of histone and DNA methylation. Current Opinion in Structural Biology, 35, 68–75. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2015.09.007
Tumor Suppressor Gene. (2024, May 29). https://www.genome.gov/genetics-glossary/Tumor-Suppressor-Gene
Vaquero, A., Loyola, A., & Reinberg, D. (2003). The constantly changing face of chromatin. Science of Aging Knowledge Environment : SAGE KE, 2003, RE4.
Vasilopoulou, C. G., Sulek, K., Brunner, A.-D., Meitei, N. S., Schweiger-Hufnagel, U., Meyer, S. W., Barsch, A., Mann, M., & Meier, F. (2020). Trapped ion mobility spectrometry and PASEF enable in-depth lipidomics from minimal sample amounts. Nature Communications, 11(1), 331. https://doi.org/10.1038/s41467-019-14044-x
Vestal, M. L., & Campbell, J. M. (2005). Tandem Time‐of‐Flight Mass Spectrometry. In Methods in Enzymology (Vol. 402, pp. 79–108). Academic Press. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(05)02003-3
