Hoe licht ons helpt de “vingerafdruk” van een cel te ontdekken
Hoe licht ons helpt de “vingerafdruk” van een cel te ontdekken
Licht speelt een onmisbare rol in ons dagelijks leven. Zonder licht zouden we in volledige duisternis leven, en onze ogen zouden nutteloos zijn. Maar licht is veel meer dan alleen iets waarmee we kunnen zien. Wetenschappers gebruiken het vandaag om ongelooflijk kleine dingen zichtbaar te maken, tot zelfs de krachten waarmee cellen aan hun omgeving trekken of duwen. Die krachten zijn zo klein dat ze wel 10.000 keer zwakker zijn dan het gewicht van een vlieg op je hand. Met speciale technieken laten onderzoekers licht interageren met eiwitten in de cel, waardoor ze die minieme bewegingen en spanningen kunnen meten. In dit artikel lees je hoe licht hen helpt om de unieke “vingerafdruk” van een cel bloot te leggen.
Licht ontrafeld: van licht naar energie
Om te begrijpen hoe licht kan helpen bij het bestuderen van cellen, moeten we eerst even terug naar de basis. Licht bestaat niet alleen uit golven, maar ook uit kleine pakketjes energie die we fotonen noemen. Elke kleur licht heeft een eigen golflengte, de afstand tussen twee toppen van een lichtgolf, die bepaalt welke kleur we zien. Hoe langer de golflengte, hoe roder het licht; hoe korter, hoe blauwer. Rood licht bevat minder energie, blauw licht juist meer. Dankzij dat verschil kunnen wetenschappers licht gebruiken als een uiterst precieze energiebron in hun experimenten. Zo kunnen ze specifieke moleculen in een cel laten oplichten of zelfs hun gedrag beïnvloeden.
Spelen met licht
Een van de meest bijzondere toepassingen van licht in de biologie zijn de FRET-sensoren. FRET klinkt misschien als een schattig diertje, maar het staat hier voor Förster Resonance Energy Transfer. Het principe is eenvoudiger dan het klinkt: FRET laat onderzoekers zien hoe dicht twee moleculen bij elkaar staan. Zo’n FRET-sensor bestaat uit twee fluorescerende eiwitten, denk aan minuscule lampjes, die met een soort veer aan elkaar vastzitten. Wanneer licht op het eerste lampje schijnt, neemt het de energie op en straalt het licht uit in een andere kleur. Zit het tweede lampje dichtbij genoeg, dan vangt het dat licht op en gaat het zelf ook gloeien, opnieuw in een andere tint. Door te meten hoeveel licht van het tweede eiwit afkomstig is, kunnen wetenschappers berekenen hoe dicht de twee lampjes bij elkaar staan. Hoe dichter ze zijn, hoe efficiënter de energie wordt doorgegeven. Zo kunnen onderzoekers met licht afstanden meten op nanoschaal, kleiner dan een tienduizendste van een haarbreedte.
FRET als krachtmeting in cellen
Omdat FRET-sensoren uit eiwitten bestaan, kunnen cellen ze zelf aanmaken. Door het DNA dat de code voor de sensor bevat in cellen te brengen, bouwen de cellen de sensor volledig zelfstandig. Wetenschappers kunnen zelfs bepalen in welk specifiek eiwit de sensor moet worden geplaatst. In dit onderzoek werd de FRET-sensor ingebouwd in het eiwit vinculine. Vinculine bevindt zich in zogenaamde focal adhesions: de contactpunten waarmee een cel zich vasthecht aan haar omgeving. Je kan ze zien als de vingerafdruk van een cel, omdat ze laten zien hoe sterk de cel zich hecht en kracht uitoefent. Een eiwit bestaat uit verschillende onderdelen, domeinen genoemd. Tussen die domeinen kan de FRET-sensor worden ingebouwd, zodat precies kan worden gemeten wat er binnen het eiwit gebeurt. Door de sensor in vinculine te plaatsen, kunnen onderzoekers de spanning in de focal adhesions meten. Zo zien ze hoeveel kracht een cel uitoefent op haar omgeving, en dus hoe actief ze is. Cellen die meer kracht uitoefenen, zijn actiever; cellen die minder kracht geven, rustiger.
FRET-sensoren onthullen cel gedrag
Met deze techniek kunnen onderzoekers beter begrijpen hoe cellen zich gedragen. In ons lichaam bevinden zich bijvoorbeeld fibroblasten, cellen die een belangrijke rol spelen bij wondgenezing. Normaal zijn fibroblasten rustig, maar bij een wonde veranderen ze in een actievere vorm, de myofibroblast, die meer kracht uitoefent om de wondranden samen te trekken. Er bestaat echter ook een minder goedaardige variant: de kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF’s, Cancer Associated Fibroblasts). Deze cellen bevinden zich in de buurt van kankercellen en spelen een gevaarlijke rol. Ze helpen tumoren groeien en verspreiden, en maken het moeilijker voor medicijnen om de kankercellen te bereiken. In dit onderzoek hebben ze met behulp van FRET-sensoren gekeken of er een verschil is tussen rustige en actieve CAF’s. En dat bleek inderdaad zo te zijn. Actieve CAF’s oefenen duidelijk meer kracht uit op hun omgeving via de focal adhesions, en ze hebben er ook meer van dan de rustige cellen.
Deze resultaten tonen dat FRET-sensoren niet alleen handig zijn om krachten te meten, maar ook om cel gedrag te begrijpen. Ze laten ons letterlijk zien welke cellen actief zijn, hoe ze zich gedragen en hoe ze hun omgeving beïnvloeden.
Dankzij FRET-sensoren zien we in het linker beeld een actieve cel vol focal adhesions, terwijl het rechter beeld een twee inactieve cellen toont.
Nieuwe inzichten in kankeronderzoek
De ontdekking dat actieve CAF’s meer kracht uitoefenen, is belangrijk voor het kankeronderzoek. Het betekent dat we niet alleen naar de kankercellen zelf moeten kijken, maar ook naar de cellen die hen omringen. Die ondersteunende cellen kunnen namelijk het verschil maken tussen een tumor die groeit of een die tot stilstand komt. Als we erin slagen om de actieve vorm van CAF’s te onderdrukken, zouden kankercellen zich minder goed kunnen verspreiden en zouden medicijnen hun doel beter kunnen bereiken. FRET opent daarmee de deur naar nieuwe behandelingsstrategieën waarbij niet alleen de kankercellen, maar ook hun “helpers” worden aangepakt.
Licht als krachtig hulpmiddel
Licht lijkt misschien iets heel gewoons, het zorgt ervoor dat we kunnen zien wat er om ons heen gebeurt. Maar inmiddels is licht veel meer dan dat: het is een onmisbaar hulpmiddel geworden voor wetenschappers. Met slimme technieken zoals FRET kunnen ze nu zelfs de kleinste processen in levende cellen volgen. Dankzij licht kunnen we letterlijk meekijken met wat cellen doen, hoe ze krachten uitoefenen en hoe dat verandert als een cel verandert.
Bibliografie
(1) Plikus, M. V.; Wang, X.; Sinha, S.; Forte, E.; Thompson, S. M.; Herzog, E. L.; Driskell, R.
R.; Rosenthal, N.; Biernaskie, J.; Horsley, V. Fibroblasts: Origins, Definitions, and
Functions in Health and Disease. Cell 2021, 184 (15), 3852–3872.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.06.024.
(2) Cialdai, F.; Risaliti, C.; Monici, M. Role of Fibroblasts in Wound Healing and Tissue
Remodeling on Earth and in Space. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10, 958381.
https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.958381.
(3) DeLeon-Pennell, K. Y.; Barker, T. H.; Lindsey, M. L. Fibroblasts: The Arbiters of
Extracellular Matrix Remodeling. Matrix Biol. 2020, 91–92, 1–7.
https://doi.org/10.1016/j.matbio.2020.05.006.
(4) Maia, F. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L., Eds. Handbook of the Extracellular Matrix:
Biologically-Derived Materials; Springer International Publishing 2024.
https://doi.org/10.1007/978-3-031-56363-8.
(5) Sahai, E.; Astsaturov, I.; Cukierman, E.; DeNardo, D. G.; Egeblad, M.; Evans, R. M.;
Fearon, D.; Greten, F. R.; Hingorani, S. R.; Hunter, T.; Hynes, R. O.; Jain, R. K.;
Janowitz, T.; Jorgensen, C.; Kimmelman, A. C.; Kolonin, M. G.; Maki, R. G.; Powers,
R. S.; Pur., E.; Ramirez, D. C.; Scherz-Shouval, R.; Sherman, M. H.; Stewart, S.;
Tlsty, T. D.; Tuveson, D. A.; Watt, F. M.; Weaver, V.; Weeraratna, A. T.; Werb, Z. A
Framework for Advancing Our Understanding of Cancer-Associated Fibroblasts. Nat.
Rev. Cancer 2020, 20 (3), 174–186. https://doi.org/10.1038/s41568-019-0238-1.
(6) Nakaya, Y.; Sheng, G. Epithelial to Mesenchymal Transition during Gastrulation: An
Embryological View. Dev. Growth Differ. 2008, 50 (9), 755–766.
https://doi.org/10.1111/j.1440-169X.2008.01070.x.
(7) Joseph, N. M.; Mukouyama, Y.; Mosher, J. T.; Jaegle, M.; Crone, S. A.; Dormand, E.-L.;
Lee, K.-F.; Meijer, D.; Anderson, D. J.; Morrison, S. J. Neural Crest Stem Cells
Undergo Multilineage Differentiation in Developing Peripheral Nerves to Generate
Endoneurial Fibroblasts in Addition to Schwann Cells. Development 2004, 131 (22),
5599–5612. https://doi.org/10.1242/dev.01429.
(8) Kalluri, R. The Biology and Function of Fibroblasts in Cancer. Nat. Rev. Cancer 2016, 16
(9), 582–598. https://doi.org/10.1038/nrc.2016.73.
(9) Kalluri, R.; Zeisberg, M. Fibroblasts in Cancer. Nat. Rev. Cancer 2006, 6 (5), 392–401.
https://doi.org/10.1038/nrc1877.
(10) Tomasek, J. J.; Gabbiani, G.; Hinz, B.; Chaponnier, C.; Brown, R. A. Myofibroblasts
and Mechano-Regulation of Connective Tissue Remodelling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
2002, 3 (5), 349–363. https://doi.org/10.1038/nrm809.
(11) Simian, M.; Hirai, Y.; Navre, M.; Werb, Z.; Lochter, A.; Bissell, M. J. The Interplay of
Matrix Metalloproteinases, Morphogens and Growth Factors Is Necessary for
Branching of Mammary Epithelial Cells. Development 2001, 128 (16), 3117–3131.
https://doi.org/10.1242/dev.128.16.3117.
(12) Brouty-Boy., D.; Pottin-Cl.menceau, C.; Doucet, C.; Jasmin, C.; Azzarone, B.
Chemokines and CD40 Expression in Human Fibroblasts. Eur. J. Immunol. 2000, 30
(3), 914–919. https://doi.org/10.1002/1521-4141(200003)30:3<914::AIDIMMU914>
3.0.CO;2-D.
(13) Desmouliere, A.; Darby, I. A.; Laverdet, B.; Bont., F. Fibroblasts and Myofibroblasts in
Wound Healing. Clin. Cosmet. Investig. Dermatol. 2014, 301.
https://doi.org/10.2147/CCID.S50046.
60
(14) Younesi, F. S.; Miller, A. E.; Barker, T. H.; Rossi, F. M. V.; Hinz, B. Fibroblast and
Myofibroblast Activation in Normal Tissue Repair and Fibrosis. Nat. Rev. Mol. Cell
Biol. 2024, 25 (8), 617–638. https://doi.org/10.1038/s41580-024-00716-0.
(15) Hanahan, D.; Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell 2011,
144 (5), 646–674. https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.02.013.
(16) Vong, S.; Kalluri, R. The Role of Stromal Myofibroblast and Extracellular Matrix in
Tumor Angiogenesis. Genes Cancer 2011, 2 (12), 1139–1145.
https://doi.org/10.1177/1947601911423940.
(17) Quail, D. F.; Joyce, J. A. Microenvironmental Regulation of Tumor Progression and
Metastasis. Nat. Med. 2013, 19 (11), 1423–1437. https://doi.org/10.1038/nm.3394.
(18) Ronnov-Jessen, L.; Petersen, O. W.; Bissell, M. J. Cellular Changes Involved in
Conversion of Normal to Malignant Breast: Importance of the Stromal Reaction.
Physiol. Rev. 1996, 76 (1), 69–125. https://doi.org/10.1152/physrev.1996.76.1.69.
(19) .hlund, D.; Elyada, E.; Tuveson, D. Fibroblast Heterogeneity in the Cancer Wound. J.
Exp. Med. 2014, 211 (8), 1503–1523. https://doi.org/10.1084/jem.20140692.
(20) Marsh, T.; Pietras, K.; McAllister, S. S. Fibroblasts as Architects of Cancer
Pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Basis Dis. 2013, 1832 (7), 1070–
1078. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2012.10.013.
(21) Dvorak, H. F. Tumors:Do Not Heal—Redux. Cancer Immunol Res. 2015, 3 (1), 1–11.
https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-14-0209
(22) Durning, P., & Schor, S. L. Fibroblasts From Patients With Breast Cancer Shows
Abnormal Behaviour In Vitro. Lancet 1984, 324 (8408), 890–892.
https://doi.org/10.1016/S0140-6736(84)90653-6
(23) Elenbaas, B.; Weinberg, R. A. Heterotypic Signaling between Epithelial Tumor Cells
and Fibroblasts in Carcinoma Formation. Exp. Cell Res. 2001, 264 (1), 169–184.
https://doi.org/10.1006/excr.2000.5133.
(24) Najafi, M.; Farhood, B.; Mortezaee, K. Extracellular Matrix (ECM) Stiffness and
Degradation as Cancer Drivers. J. Cell. Biochem. 2019, 120 (3), 2782–2790.
https://doi.org/10.1002/jcb.27681.
(25) Fukumura, D.; Xavier, R.; Sugiura, T.; Chen, Y.; Park, E.-C.; Lu, N.; Selig, M.; Nielsen,
G.; Taksir, T.; Jain, R. K.; Seed, B. Tumor Induction of VEGF Promoter Activity in
Stromal Cells. Cell 1998, 94 (6), 715–725. https://doi.org/10.1016/S0092-
8674(00)81731-6.
(26) Brown, L. F., Guidi, A. J., Schnitt, S. J., Van De Water, L., Iruela-Arispe, M. L., Yeo, T.
K., Tognazzi, K., & Dvorak, H. F. (1999). Vascular Stroma Formation in Carcinoma in
Situ, Invasive Carcinoma, and Metastatic Carcinoma of the Breast. Clin Cancer Res.
1999, 5 (5), 1041–1056.
(27) Desmouli.re, A., Geinoz, A., Gabbiani, F., & Gabbiani, G. Transforming growth factorbeta
1 induces alpha-smooth muscle actin expression in granulation tissue
myofibroblasts and in quiescent and growing cultured fibroblasts. J. Cell Biol. 1993,
122 (1), 103-111.
(28) Xu, G.; Bochaton-Piallat, M.; Andreutti, D.; Low, R. B.; Gabbiani, G.; Neuville, P.
Regulation of Α-smooth Muscle Actin and CRBP-1 Expression by Retinoic Acid and
TGF-β in Cultured Fibroblasts. J. Cell. Physiol. 2001, 187 (3), 315–325.
https://doi.org/10.1002/jcp.1078.
(29) Massagu., J.; Sheppard, D. TGF-β Signaling in Health and Disease. Cell 2023, 186
(19), 4007–4037. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.07.036.
61
(30) Kuehlmann, B.; Bonham, C. A.; Zucal, I.; Prantl, L.; Gurtner, G. C.
Mechanotransduction in Wound Healing and Fibrosis. J. Clin. Med. 2020, 9 (5), 1423.
https://doi.org/10.3390/jcm9051423.
(31) Bayer, I. S. Advances in Fibrin-Based Materials in Wound Repair: A Review. Molecules
2022, 27 (14), 4504. https://doi.org/10.3390/molecules27144504.
(32) Saraswathibhatla, A.; Indana, D.; Chaudhuri, O. Cell–Extracellular Matrix
Mechanotransduction in 3D. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2023, 24 (7), 495–516.
https://doi.org/10.1038/s41580-023-00583-1.
(33) Ciobanasu, C.; Faivre, B.; Le Clainche, C. Integrating Actin Dynamics,
Mechanotransduction and Integrin Activation: The Multiple Functions of Actin Binding
Proteins in Focal Adhesions. Eur. J. Cell Biol. 2013, 92 (10–11), 339–348.
https://doi.org/10.1016/j.ejcb.2013.10.009.
(34) Kadry, Y. A.; Calderwood, D. A. Chapter 22: Structural and Signaling Functions of
Integrins. Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2020, 1862 (5), 183206.
https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2020.183206.
(35) Roberts, G. C. K.; Critchley, D. R. Structural and Biophysical Properties of the Integrin-
Associated Cytoskeletal Protein Talin. Biophys. Rev. 2009, 1 (2), 61–69.
https://doi.org/10.1007/s12551-009-0009-4.
(36) Xu, W.; Baribault, H.; Adamson, E. D. Vinculin Knockout Results in Heart and Brain
Defects during Embryonic Development. Development 1998, 125 (2), 327–337.
https://doi.org/10.1242/dev.125.2.327.
(37) DeMali, K. A.; Barlow, C. A.; Burridge, K. Recruitment of the Arp2/3 Complex to
Vinculin. J. Cell Biol. 2002, 159 (5), 881–891. https://doi.org/10.1083/jcb.200206043.
(38) Bays, J. L.; DeMali, K. A. Vinculin in Cell–Cell and Cell–Matrix Adhesions. Cell. Mol.
Life Sci. 2017, 74 (16), 2999–3009. https://doi.org/10.1007/s00018-017-2511-3.
(39) Peng, X.; Nelson, E. S.; Maiers, J. L.; DeMali, K. A. New Insights into Vinculin Function
and Regulation. International Review of Cell and Molecular Biology, 2011, 287, 191–
231. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-386043-9.00005-0.
(40) Chorev, D. S.; Volberg, T.; Livne, A.; Eisenstein, M.; Martins, B.; Kam, Z.; Jockusch, B.
M.; Medalia, O.; Sharon, M.; Geiger, B. Conformational States during Vinculin
Unlocking Differentially Regulate Focal Adhesion Properties. Sci. Rep. 2018, 8 (1,),
2693. https://doi.org/10.1038/s41598-018-21006-8.
(41) Chen, H.; Cohen, D. M.; Choudhury, D. M.; Kioka, N.; Craig, S. W. Spatial Distribution
and Functional Significance of Activated Vinculin in Living Cells. J. Cell Biol. 2005,
169 (3), 459–470. https://doi.org/10.1083/jcb.200410100.
(42) Lakowicz, J. R.; Masters, B. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition.
J. Biomed. Opt. 2008, 13 (2), 029901. https://doi.org/10.1117/1.2904580.
(43) Vangindertael, J.; Camacho, R.; Sempels, W.; Mizuno, H.; Dedecker, P.; Janssen, K.
P. F. An Introduction to Optical Super-Resolution Microscopy for the Adventurous
Biologist. Methods Appl. Fluoresc. 2018, 6 (2), 022003. https://doi.org/10.1088/2050-
6120/aaae0c.
(44) Mazi, W. A. Near-infrared fluorescent probes for sensitive determination of lysosomal &
mitochondrial pH in live cells (Doctoral dissertation, Michigan Technological
University), 2019. https://doi.org/10.37099/mtu.dc.etdr/899.Michigan, 2019.
https://doi.org/10.37099/mtu.dc.etdr/899.
(45) Sahoo, H. F.rster Resonance Energy Transfer – A Spectroscopic Nanoruler: Principle
and Applications. J. Photochem. Photobiol. C Photochem. Rev. 2011, 12 (1), 20–30.
https://doi.org/10.1016/j.jphotochemrev.2011.05.001.
62
(46) Sekatskii, S. K.; Dukenbayev, K.; Mensi, M.; Mikhaylov, A. G.; Rostova, E.; Smirnov,
A.; Suriyamurthy, N.; Dietler, G. Single Molecule Fluorescence Resonance Energy
Transfer Scanning Near-Field Optical Microscopy: Potentials and Challenges.
Faraday Discuss. 2015, 184, 51–69. https://doi.org/10.1039/C5FD00097A.
(47) Kenworthy, A. K. Imaging Protein-Protein Interactions Using Fluorescence Resonance
Energy Transfer Microscopy. Methods 2001, 24 (3), 289–296.
https://doi.org/10.1006/meth.2001.1189.
(48) Zong, H.; Madden, A.; Ward, M.; Mooney, M. H.; Elliott, C. T.; Stitt, A. W.
Homodimerization Is Essential for the Receptor for Advanced Glycation End Products
(RAGE)-Mediated Signal Transduction. J. Biol. Chem. 2010, 285 (30), 23137–23146.
https://doi.org/10.1074/jbc.M110.133827.
(49) Wilson, M.; DeRose, J.; Greb, C. Introduction to Widefield Microscopy. Leica
microsystems 2017. https://www.leica-microsystems.com/science-lab/microscopybasics/
introduction-to-widefield-microscopy/ (accessed 2025-05-25).
(50) Jonkman, J.; Brown, C. M. Any Way You Slice It—A Comparison of Confocal
Microscopy Techniques. J. Biomol. Tech. JBT 2015, 26 (2), 54–65.
https://doi.org/10.7171/jbt.15-2602-003.
(51) Borlinghaus, R. T. Pinhole Effect in Confocal Microscopes, Leica microsystems 2017.
https://www.leica-microsystems.com/science-lab/life-science/pinhole-eff…-
microscopes/ (accessed 2025-05-25).
(52) Alt, P. J. RESOLFT Nanoscopy with Water-Soluble Synthetic Fluorophores, (Doctoral
dissertation, Georg-August-Universit.t G.ttingen) 2018.
https://doi.org/10.53846/goediss-6679.
(53) Zeug, A.; Woehler, A.; Neher, E.; Ponimaskin, E. G. Quantitative Intensity-Based FRET
Approaches—A Comparative Snapshot. Biophys. J. 2012, 103 (9), 1821–1827.
https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.09.031.
(54) Gadella, T. W. J.; Jovin, T. M.; Clegg, R. M. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
(FLIM): Spatial Resolution of Microstructures on the Nanosecond Time Scale.
Biophys. Chem. 1993, 48 (2), 221–239. https://doi.org/10.1016/0301-4622(93)85012-
7.
(55) Lakowicz, J. R.; Berndt, K. W. Lifetime-Selective Fluorescence Imaging Using an Rf
Phase-Sensitive Camera. Rev. Sci. Instrum. 1991, 62 (7), 1727–1734.
https://doi.org/10.1063/1.1142413.
(56) Leray, A.; Spriet, C.; Trinel, D.; Blossey, R.; Usson, Y.; H.liot, L. Quantitative
Comparison of Polar Approach versus Fitting Method in Time Domain FLIM Image
Analysis. Cytometry A 2011, 79A (2), 149–158. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20996.
(57) Jares-Erijman, E. A.; Jovin, T. M. FRET Imaging. Nat. Biotechnol. 2003, 21 (11), 1387–
1395. https://doi.org/10.1038/nbt896.
(58) Redford, G. I.; Clegg, R. M. Polar Plot Representation for Frequency-Domain Analysis
of Fluorescence Lifetimes. J. Fluoresc. 2005, 15 (5), 805–815.
https://doi.org/10.1007/s10895-005-2990-8.
(59) Rajoria, S.; Zhao, L.; Intes, X.; Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Curr.
Mol. Imaging 2015, 3 (2), 144–161.
https://doi.org/10.2174/2211555203666141117221111.
(60) Becker, W. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. Springer
Ser. Chem. Phys. 2005, https://doi.org/10.1007/3-540-28882-1
(61) Kapusta, P., Wahl, M., Erdmann, R. Advanced Photon Counting: Applications,
Methods, Instrumentation. Springer Nature 2015, 15, https://doi.org/10.1007/978-3-
319-15636-1
(62) Kalisz, J. Review of Methods for Time Interval Measurements with Picosecond
Resolution. Metrologia 2004, 41 (1), 17–32. https://doi.org/10.1088/0026-
1394/41/1/004.
(63) Alvarez, L. A. J., Widzgowski, B., Ossato, G., van den Broek, B., Jalink, K., Kuschel, L.,
Roberti, M. J., & Hecht, F. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime
imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nat. Methods 2019, 16 (10).
(64) Coucke, Q. From Theory to Practice: Phasor-Based Insights into FRET-Sensing
(Doctoral dissertation, KU Leuven). 2024
(65) Martelo, L.; Fedorov, A.; Berberan-Santos, M. N. Fluorescence Phasor Plots Using
Time Domain Data: Effect of the Instrument Response Function. J. Phys. Chem. B
2015, 119 (32), 10267–10274. https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.5b00261.
(66) Hinz, B.; Dugina, V.; Ballestrem, C.; Wehrle-Haller, B.; Chaponnier, C. α-Smooth
muscle actin is crucial for focal adhesion maturation in myofibroblasts. MBoC.
2003, 14 (6), 2508-2519.
(67) Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 2005, 42
(4), 405–426. https://doi.org/10.1354/vp.42-4-405.
(68) Lan, H. Y.; Mu, W.; Nikolic-Paterson, D. J.; Atkins, R. C. A Novel, Simple, Reliable, and
Sensitive Method for Multiple Immunoenzyme Staining: Use of Microwave Oven
Heating to Block Antibody Crossreactivity and Retrieve Antigens. J. Histochem.
Cytochem. 1995, 43 (1), 97–102. https://doi.org/10.1177/43.1.7822770.
(69) Park, G.; Kim, S. S.; Shim, J.; Lee, S.-J. V. Brief Guide to Immunostaining. Mol. Cells
2025, 48 (1), 100157. https://doi.org/10.1016/j.mocell.2024.100157.
(70) Im, K.; Mareninov, S.; Diaz, M. F. P.; Yong, W. H. An Introduction to Performing
Immunofluorescence Staining. In Biobanking; Yong, W. H., Ed.; Methods in Molecular
Biology; Springer New York: New York, NY, 2019, 1897, 299–311.
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8935-5_26.
(71) Pi.a, R.; Santos-D.az, A. I.; Orta-Salazar, E.; Aguilar-Vazquez, A. R.; Mantellero, C. A.;
Acosta-Galeana, I.; Estrada-Mondragon, A.; Prior-Gonzalez, M.; Martinez-Cruz, J. I.;
Rosas-Arellano, A. Ten Approaches That Improve Immunostaining: A Review of the
Latest Advances for the Optimization of Immunofluorescence. Int. J. Mol. Sci. 2022,
23 (3), 1426. https://doi.org/10.3390/ijms23031426.
(72) Lekka, M.; Gnanachandran, K.; Kubiak, A.; Zieliński, T.; Zemła, J. Traction Force
Microscopy – Measuring the Forces Exerted by Cells. Micron 2021, 150, 103138.
https://doi.org/10.1016/j.micron.2021.103138.
(73) LaCroix, A. S.; Lynch, A. D.; Berginski, M. E.; Hoffman, B. D. Tunable Molecular
Tension Sensors Reveal Extension-Based Control of Vinculin Loading. eLife 2018, 7,
e33927. https://doi.org/10.7554/eLife.33927.
(74) Grashoff, C.; Hoffman, B. D.; Brenner, M. D.; Zhou, R.; Parsons, M.; Yang, M. T.;
McLean, M. A.; Sligar, S. G.; Chen, C. S.; Ha, T.; Schwartz, M. A. Measuring
Mechanical Tension across Vinculin Reveals Regulation of Focal Adhesion Dynamics.
Nature 2010, 466 (7303), 263–266. https://doi.org/10.1038/nature09198.
(75) Doyle, A. D.; Wang, F. W.; Matsumoto, K.; Yamada, K. M. One-Dimensional
Topography Underlies Three-Dimensional Fibrillar Cell Migration. J. Cell Biol. 2009,
184 (4), 481–490. https://doi.org/10.1083/jcb.200810041.
64
(76) Provenzano, P. P.; Keely, P. J. Mechanical Signaling through the Cytoskeleton
Regulates Cell Proliferation by Coordinated Focal Adhesion and Rho GTPase
Signaling. J. Cell Sci. 2011, 124 (8), 1195–1205. https://doi.org/10.1242/jcs.067009.
(77) Heo, S.-J.; Driscoll, T. P.; Thorpe, S. D.; Nerurkar, N. L.; Baker, B. M.; Yang, M. T.;
Chen, C. S.; Lee, D. A.; Mauck, R. L. Differentiation Alters Stem Cell Nuclear
Architecture, Mechanics, and Mechano-Sensitivity. eLife 2016, 5, e18207.
https://doi.org/10.7554/eLife.18207.
(78) Heisenberg, C.-P.; Bella.che, Y. Forces in Tissue Morphogenesis and Patterning. Cell
2013, 153 (5), 948–962. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.008.
(79) Ranjit, S.; Malacrida, L.; Jameson, D. M.; Gratton, E. Fit-Free Analysis of Fluorescence
Lifetime Imaging Data Using the Phasor Approach. Nat. Protoc. 2018, 13 (9), 1979–
2004. https://doi.org/10.1038/s41596-018-0026-5.
(80) Aytekin, S.; Kimps, L.; Coucke, Q.; Linhares, D.; Deodhar, S.; Cardinaels, R.; C.ndor,
M.; Barrasa-Fano, J.; Oosterwyck, H. V.; Rocha, S. Linking Molecular Tension and
Cellular Tractions: A Multiscale Approach to Focal Adhesion Mechanics. bioRxiv
2025. https://doi.org/10.1101/2025.01.09.632081.
(81) Lam, A. J.; St-Pierre, F.; Gong, Y.; Marshall, J. D.; Cranfill, P. J.; Baird, M. A.;
McKeown, M. R.; Wiedenmann, J.; Davidson, M. W.; Schnitzer, M. J.; Tsien, R. Y.;
Lin, M. Z. Improving FRET Dynamic Range with Bright Green and Red Fluorescent
Proteins. Nat. Methods 2012, 9 (10), 1005–1012. https://doi.org/10.1038/nmeth.2171.
(82) Matela, G.; Gao, P.; Guigas, G.; Eckert, A. F.; Nienhaus, K.; Ulrich Nienhaus, G. A Far-
Red Emitting Fluorescent Marker Protein, mGarnet2, for Microscopy and STED
Nanoscopy. Chem. Commun. 2017, 53 (5), 979–982.
https://doi.org/10.1039/C6CC09081H.
(83) Subach, O. M.; Cranfill, P. J.; Davidson, M. W.; Verkhusha, V. V. An Enhanced
Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the
Chromophore. PLoS ONE 2011, 6 (12), e28674.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028674.
(84) Dees, C.; Tomcik, M.; Palumbo-Zerr, K.; Distler, A.; Beyer, C.; Lang, V.; Horn, A.; Zerr,
P.; Zwerina, J.; Gelse, K.; Distler, O.; Schett, G.; Distler, J. H. W. JAK-2 as a Novel
Mediator of the Profibrotic Effects of Transforming Growth Factor β in Systemic
Sclerosis. Arthritis Rheum. 2012, 64 (9), 3006–3015.
https://doi.org/10.1002/art.34500.
(85) Działo, E.; Czepiel, M.; Tkacz, K.; Siedlar, M.; Kania, G.; Błyszczuk, P. WNT/β-Catenin
Signaling Promotes TGF-β-Mediated Activation of Human Cardiac Fibroblasts by
Enhancing IL-11 Production. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22 (18), 10072.
https://doi.org/10.3390/ijms221810072.
(86) Meyer-ter-Vehn, T.; Han, H.; Grehn, F.; Schlunck, G. Extracellular Matrix Elasticity
Modulates TGF-β–Induced P38 Activation and Myofibroblast Transdifferentiation in
Human Tenon Fibroblasts. Investig. Opthalmology Vis. Sci. 2011, 52 (12), 9149.
https://doi.org/10.1167/iovs.10-6679.
(87) Stylianou, A.; Gkretsi, V.; Stylianopoulos, T. Transforming Growth Factor-β Modulates
Pancreatic Cancer Associated Fibroblasts Cell Shape, Stiffness and Invasion.
Biochim. Biophys. Acta BBA - Gen. Subj. 2018, 1862 (7), 1537–1546.
https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2018.02.009.
(88) Geiger, B.; Bershadsky, A.; Pankov, R.; Yamada, K. M. Transmembrane extracellular
Matrix-Cytoskeleton crosstalk. 2001.
65
(89) Min, J.-J.; Iyer, M.; Gambhir, S. S. Comparison of [ 18 F]FHBG and [ 14 C]FIAU for
Imaging of HSV1-Tk Reporter Gene Expression: Adenoviral Infection vs Stable
Transfection. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 2003, 30 (11), 1547–1560.
https://doi.org/10.1007/s00259-003-1238-6.
(90) Transient vs. stable cell line: Weighing the pros and cons. Cell Culture Company 2024
https://cellculturecompany.com/transient-vs-stable-cell-line-weighing-t…
(accessed 2025-05-26).
(91) Calvo, F.; Ege, N.; Grande-Garcia, A.; Hooper, S.; Jenkins, R. P.; Chaudhry, S. I.;
Harrington, K.; Williamson, P.; Moeendarbary, E.; Charras, G.; Sahai, E.
Mechanotransduction and YAP-Dependent Matrix Remodelling Is Required for the
Generation and Maintenance of Cancer-Associated Fibroblasts. Nat. Cell Biol. 2013,
15 (6), 637–646. https://doi.org/10.1038/ncb2756.
(92) Carisey, A.; Tsang, R.; Greiner, A. M.; Nijenhuis, N.; Heath, N.; Nazgiewicz, A.;
Kemkemer, R.; Derby, B.; Spatz, J.; Ballestrem, C. Vinculin Regulates the
Recruitment and Release of Core Focal Adhesion Proteins in a Force-Dependent
Manner. Curr. Biol. 2013, 23 (4), 271–281. https://doi.org/10.1016/j.cub.2013.01.009.
(93) Hirata, H.; Tatsumi, H.; Lim, C. T.; Sokabe, M. Force-Dependent Vinculin Binding to
Talin in Live Cells: A Crucial Step in Anchoring the Actin Cytoskeleton to Focal
Adhesions. Am. J. Physiol.-Cell Physiol. 2014, 306 (6), C607–C620.
https://doi.org/10.1152/ajpcell.00122.2013.
(94) Bene, L.; Damjanovich, L. F.rster Resonance Energy Transfer Pioneers Biomechanics:
Molecular-Scale Force Meters for Visualizing Intracellular Stress Fields. Cytometry A
2019, 95 (8), 819–822. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23780.
(95) Gates, E. M.; LaCroix, A. S.; Rothenberg, K. E.; Hoffman, B. D. Improving Quality,
Reproducibility, and Usability of FRET-Based Tension Sensors. Cytometry A 2019, 95
(2), 201–213. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23688.
(96) Glover, D. J.; Lipps, H. J.; Jans, D. A. Towards Safe, Non-Viral Therapeutic Gene
Expression in Humans. Nat. Rev. Genet. 2005, 6 (4), 299–310.
https://doi.org/10.1038/nrg1577.
(97) Barshad, G.; Lewis, J. J.; Chivu, A. G.; Abuhashem, A.; Krietenstein, N.; Rice, E. J.;
Ma, Y.; Wang, Z.; Rando, O. J.; Hadjantonakis, A.-K.; Danko, C. G. RNA Polymerase
II Dynamics Shape Enhancer–Promoter Interactions. Nat. Genet. 2023, 55 (8), 1370–
1380. https://doi.org/10.1038/s41588-023-01442-7.
(98) Whitesell, T. R.; Kennedy, R. M.; Carter, A. D.; Rollins, E.-L.; Georgijevic, S.; Santoro,
M. M.; Childs, S. J. An α-Smooth Muscle Actin (Acta2/Αsma) Zebrafish Transgenic
Line Marking Vascular Mural Cells and Visceral Smooth Muscle Cells. PLoS
