De genetische puzzel van het hart oplossen met een vis
Hartspierziekten zijn een verzameling van aandoeningen waarbij de hartspier beschadigd raakt waardoor het hart steeds minder goed bloed kan pompen. Dit kan uiteindelijk leiden tot hartfalen. Foutjes in specifieke genen kunnen leiden tot de ontwikkeling van deze ziekten. Het opsporen van deze genetische foutjes kan dokters helpen om patiënten vlugger een diagnose te geven en te behandelen. Er zijn nog veel van deze genen onbekend of onvoldoende onderzocht. Dat is waar mijn onderzoek op inspeelt. Ik heb drie gloednieuwe genen getest in zebravissen. En de resultaten? De genen waren belangrijk voor de normale functie van het hart en mogelijks voor de ontwikkeling van hartspierziekten.
Hartspierziekten bij de mens
Hartspierziekten, ook wel cardiomyopathieën genoemd, komen vaker voor dan de meeste mensen denken. Maar liefst 1 op de 250 mensen ontwikkelen een hartspierziekte in de loop van hun leven. Hartspierziekten zorgen voor schade in de hartspier, waardoor het hart zijn functie steeds slechter kan uitvoeren. Dit zorgt ervoor dat patiënten kortademig worden en vocht gaan vasthouden in de armen en benen. Uiteindelijk gaan hartspierziekten vaak over in hartfalen. Er is ook een groter risico op het sudden cardiac death syndrome, waarbij het hart plotseling stopt en de patiënt sterft.
Er bestaan verschillende soorten hartspierziekten zoals gedilateerde cardiomyopathie, waarbij de hartspier uitrekt en het hart vergroot, of hypertrofe cardiomyopathie, waarbij de hartspier heel erg stroef en dik wordt. Deze ziekten zijn chronisch, wat wil zeggen dat patiënten deze ziekte voor de rest van hun leven hebben en niet genezen kunnen worden. Gelukkig bestaan er wel verschillende behandelingen die de ziekte draaglijker maken voor de patiënten en die de ziekteprogressie vertragen of stoppen. Hoe eerder men kan beginnen met deze behandelingen, hoe meer schade aan de hartspier kan worden vermeden en hoe beter de levenskwaliteit van de patiënt.
Een late diagnose
Het grote probleem is dat de diagnose van een hartspierziekte vaak laat gebeurt. Dit komt doordat symptomen pas ontstaan wanneer de schade aan het hart vergevorderd is. Een oplossing hiervoor is kijken naar het DNA. DNA is het bouwplan van ons volledige lichaam. Bepaalde stukken van ons DNA gaan samen een bepaald kenmerk van ons lichaam maken, zoals bijvoorbeeld de kleur van onze ogen. Deze delen DNA noemen we genen.
Hartspierziekten kunnen veroorzaakt worden door foutjes in bepaalde genen. Als we deze genen kennen dan kunnen we ze onderzoeken bij mensen en zien wie een groter risico heeft op het krijgen van hartspierziekten. Deze mensen kunnen dan eerder opgevolgd worden. Er zijn al meer dan 50 genen bekend waarin fouten kunnen leiden tot hartspierziekten. Maar, bij 60 tot 75% van de families waarin hartspierziekten voorkomen, en waarbij er dus sprake is van een genetische factor, zijn er geen defecten in de reeds gekende genen. Dit betekent dat er nog veel genen ongekend zijn en er dus nog veel onderzoekswerk moet gebeuren.
New gene, who’s this?
Mijn onderzoeksgroep is dus op zoek gegaan naar nieuwe genen door DNA van patiënten met hartspierziekten te onderzoeken. Deze patiënten hadden geen defecten in de gekende genen en dus hebben we gekeken naar andere genen waar wel foutjes in waren. Fouten in genen zorgen niet altijd voor een (verhoogd risico op een) ziekte. Vaak zijn er zelfs geen gevolgen aan deze kleine defecten. Dus op basis van verschillende criteria hebben we de lijst van genen met fouten gefilterd om de meest belovende kandidaten over te houden. Hieruit hebben we 3 nieuwe genen gevonden die verder onderzocht konden worden. Dit verdere onderzoek heb ik gedaan in mijn masterproef met een onverwachte, maar erg handig proefdier, namelijk de zebravis.
Waarom een zebravis?
De zebravis is een zoetwatervis, oorspronkelijk afkomstig uit India. Deze vis heeft heel veel voordelen in onderzoek naar hartziekten. Zo heeft deze vis een volledig ontwikkeld hart na 3 dagen en dit hart lijkt verrassend veel op dat van de mens. De visjes zijn ook doorzichtig in de eerste 5 dagen, waardoor je met de microscoop heel gemakkelijk het hart in beeld kan brengen. Het genetisch materiaal van een vis is ook zeer gelijkend op dat van de mens. De vis heeft maar liefst 70% van hun genen gemeenschappelijk met die van de mens. Ten slotte groeien de zebravis-embryo's buiten het lichaam van hun moeder, in eitjes die gemakkelijk geïnjecteerd kunnen worden om genetische aanpassing te maken. Daarom zijn vissen makkelijker te gebruiken zijn dan muizen, waarbij de embryo’s in de baarmoeder groeien.
Schaar met GPS
Tijdens mijn onderzoek heb ik de zebravissen genetisch aangepast om te testen wat de 3 nieuwe genen precies doen. Dit heb ik gedaan door zebravis eitjes te injecteren met een molecule genaamd CRISPR/Cas9. Deze molecule werkt als een soort “schaar met GPS”. Het CRISPR gedeelte (de GPS) helpt om naar het juiste stukje DNA in de vis te gaan. Eens dat de molecule op de juiste plek is geraakt, maakt het Cas9 gedeelte (de schaar) een knip in het DNA. Zo raakt het gen waar dat stukje DNA in zit defect.
Deze molecule heb ik dan gebruikt om ieder van de drie genen die we gevonden hadden defect te maken in verschillende zebravissen. Als de zebravissen 3 dagen oud waren, heb ik gekeken of het hart nog normaal werkte. Ik heb met de microscoop foto’s en video’s gemaakt van het kloppende hart en dan normale vissen vergeleken met de vissen waarbij de
genen defect waren. Hieruit bleek dat de genetisch aangepaste vissen problemen hadden in hun hart en circulatie. Dat bewijst dat de nieuwe genen die we gevonden hadden in patiënten daadwerkelijk een rol spelen in de ontwikkeling en functie van het hart en mogelijk bij het ontwikkelen van hartspierziekten.
En nu?
Nu kan vervolgonderzoek starten om de exacte rol van deze genen na te gaan bij de ontwikkeling van hartspierziekten. Op die manier kunnen mogelijke toekomstige hartpatiënten vroeger opgespoord en opgevolgd worden, waardoor ernstige schade aan de hartspier meer voorkomen kan worden.
Bibliografie
1. Reichart D, Magnussen C, Zeller T, Blankenberg S. Dilated cardiomyopathy: from epidemiologic to genetic phenotypes: A translational review of current literature. J Intern Med. 2019;286(4):362-72.
2. Japp AG, Gulati A, Cook SA, Cowie MR, Prasad SK. The Diagnosis and Evaluation of Dilated Cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2016;67(25):2996-3010.
3. Heymans S, Lakdawala NK, Tschope C, Klingel K. Dilated cardiomyopathy: causes, mechanisms, and current and future treatment approaches. Lancet. 2023;402(10406):998-1011.
4. Merlo M, Cannata A, Gobbo M, Stolfo D, Elliott PM, Sinagra G. Evolving concepts in dilated cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 2018;20(2):228 39.
5. Sullivan RD, Mehta RM, Tripathi R, Reed GL, Gladysheva IP. Renin Activity in Heart Failure with Reduced Systolic Function-New Insights. Int J Mol Sci. 2019;20(13).
6. Peters S, Johnson R, Birch S, Zentner D, Hershberger RE, Fatkin D. Familial Dilated Cardiomyopathy. Heart 2020;29(4):566-74.
7. Lung Circ. Wu XY, Lee YK, Lau YM, Au KW, Tse YL, Ng KM, et al. The Pathogenic Mechanisms of and Novel Therapies for Lamin A/C-Related Dilated Cardiomyopathy Based on Patient-Specific Pluripotent Stem Cell Platforms and Animal Models. Pharmaceuticals (Basel). 2024;17(8).
8. Verdonschot JAJ, Hazebroek MR, Krapels IPC, Henkens M, Raafs A, Wang P, et al. Implications of Genetic Testing in Dilated Cardiomyopathy. Circ Genom Precis Med. 2020;13(5):476-87. 21
9. Westphal JG, Rigopoulos AG, Bakogiannis C, Ludwig SE, Mavrogeni S, Bigalke B, et al. The MOGE(S) classification for cardiomyopathies: current status and future outlook. Heart Fail Rev. 2017;22(6):743-52.
10. Stroik D, Gregorich ZR, Raza F, Ge Y, Guo W. Titin: roles in cardiac function and diseases. Front Physiol. 2024;15:1385821.
11. Veltrop RJA, Kukk MM, Topouzidou K, Didden L, Muchir A, van Steenbeek FG, et al. From gene to mechanics: a comprehensive insight into the mechanobiology of LMNA mutations in cardiomyopathy. Cell 2024;22(1):197.
12. Commun Signal. Captur G, Arbustini E, Bonne G, Syrris P, Mills K, Wahbi K, et al. Lamin and the heart. Heart. 2018;104(6):468-79.
13. Begay RL, Tharp CA, Martin A, Graw SL, Sinagra G, Miani D, et al. FLNC Gene Splice Mutations Cause Dilated Cardiomyopathy. JACC Basic Transl Sci. 2016;1(5):344-59.
14. Whiffin N, Minikel E, Walsh R, O'Donnell Luria AH, Karczewski K, Ing AY, et al. Using high-resolution variant frequencies to empower clinical genome interpretation. Genet Med. 2017;19(10):1151-8.
15. Rentzsch P, Witten D, Cooper GM, Shendure J, Kircher M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D886 D94.
16. Pejaver V, Byrne AB, Feng BJ, Pagel KA, Mooney SD, Karchin R, et al. Calibration of computational tools for missense variant pathogenicity classification and ClinGen recommendations for PP3/BP4 criteria. Am J Hum Genet. 2022;109(12):2163-77.
17. Ioannidis NM, Rothstein JH, Pejaver V, Middha S, McDonnell SK, Baheti S, et al. REVEL: An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. Am J Hum Genet. 2016;99(4):877-85.
18. Gut P, Reischauer S, Stainier DYR, Arnaout R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 2017;97(3):889-938.
19. Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 1995;203(3):253-310.
20. Narumanchi S, Wang H, Perttunen S, Tikkanen I, Lakkisto P, Paavola J. Zebrafish Heart Failure Models. 2021;9:662583.
21. Front Cell Dev Biol. Howe K, Clark MD, Torroja CF, Torrance J, Berthelot C, Muffato M, et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 2013;496(7446):498 503.
22. laptm4b lysosomal protein transmembrane 4 beta [Danio rerio (zebrafish)] - Gene - NCBI [2025-01-02 ]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=Danio+ rerio+laptm4b.
23. LAPTM4B lysosomal protein transmembrane 4 beta [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI [2024-09-30 ]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55353#general-gene-info.
24. ankhd1 ankyrin repeat and KH domain containing 1 [Danio rerio (zebrafish)] - Gene - NCBI [2025-01-02 ]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=Danio+ rerio+ankhd1.
25. ANKHD1 ankyrin repeat and KH domain containing 1 [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI [2024-10-02]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54882#bibliog raphy.
26. PIGV phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class V [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI [2024-10-02]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55650.
27. pigv phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class V [Danio rerio (zebrafish)] - Gene - NCBI [2025-01-02]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=Danio+ rerio+pigv.
28. LAPTM4B - Lysosomal-associated transmembrane protein 4B - Homo sapiens (Human) | UniProtKB | UniProt [2024-12-20]. Available from: https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q86VI4/entry# sequences.
29. Milkereit R, Persaud A, Vanoaica L, Guetg A, Verrey F, Rotin D. LAPTM4b recruits the LAT1-4F2hc Leu transporter to lysosomes and promotes mTORC1 activation. Nat Commun. 2015;6:7250.
30. Wang S, Han Y, Liu R, Hou M, Neumann D, Zhang J, et al. Glycolysis-Mediated Activation of v-ATPase by Nicotinamide Mononucleotide Ameliorates Lipid-Induced Cardiomyopathy by Repressing the CD36-TLR4 Axis. Circ Res. 2024;134(5):505-25.
31. Wang S, Schianchi F, Neumann D, Wong LY, Sun A, van Nieuwenhoven FA, et al. Specific amino acid supplementation rescues the heart from lipid overload-induced insulin resistance and contractile dysfunction by targeting the endosomal mTOR-v-ATPase axis. Mol Metab. 2021;53:101293.
32. Vergarajauregui S, Martina JA, Puertollano R. LAPTMs regulate lysosomal function and interact with mucolipin 1: new clues for understanding mucolipidosis type IV. J Cell Sci. 2011;124(Pt 3):459-68.
33. Nair V, Belanger EC, Veinot JP. Lysosomal storage disorders affecting the heart: a review. Cardiovascular Pathology. 2019;39:12-24.
34. Gu S, Tan J, Li Q, Liu S, Ma J, Zheng Y, et al. Downregulation of LAPTM4B Contributes to the Impairment of the Autophagic Flux via Unopposed Activation of mTORC1 Signaling During Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury. Circ Res. 2020;127(7):e148-e65.
35. Park LK, Garr Barry V, Hong J, Heebink J, Sah R, Peterson LR. Links between ceramides and cardiac function. Curr Opin Lipidol. 2022;33(1):47-56.
36. Blom T, Li S, Dichlberger A, Back N, Kim YA, Loizides-Mangold U, et al. LAPTM4B facilitates late endosomal ceramide export to control cell death pathways. Nat Chem Biol. 2015;11(10):799-806.
37. laptm4b - Lysosomal-associated transmembrane protein 4B - Danio rerio (Zebrafish) | UniProtKB | UniProt [2025-01-02 11:36:51]. Available from: https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q801V1/entry# subcellular_location.
38. PIGV - GPI mannosyltransferase 2 - Homo sapiens (Human) | UniProtKB | UniProt [2024-10 02]. Available from: https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q9NUD9/entry #interaction.
39. Wu T, Yin F, Guang S, He F, Yang L, Peng J. The Glycosylphosphatidylinositol biosynthesis pathway in human diseases. Orphanet J Rare Dis. 2020;15(1):129.
40. Kang JY, Hong Y, Ashida H, Shishioh N, Murakami Y, Morita YS, et al. PIG-V involved in transferring the second mannose in glycosylphosphatidylinositol. J Biol Chem. 2005;280(10):9489-97.
41. Horn D, Wieczorek D, Metcalfe K, Baric I, Palezac L, Cuk M, et al. Delineation of PIGV mutation spectrum and associated phenotypes in hyperphosphatasia with mental retardation syndrome. Eur J Hum Genet. 2014;22(6):762-7.
42. Conte F, Sam JE, Lefeber DJ, Passier R. Metabolic Cardiomyopathies and Cardiac Defects in Inherited Disorders of Carbohydrate Metabolism: A Systematic Review. Int J Mol Sci. 2023;24(10).
43. ANKHD1 - Ankyrin repeat and KH domain-containing protein 1 - Homo sapiens (Human) | UniProtKB | UniProt [2024-12-02]. Available from: https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q8IWZ3/entry.
44. Mullenger JL, Zeidler MP, Fragiadaki M. Evaluating the Molecular Properties and Function of ANKHD1, and Its Role in Cancer. Int J Mol Sci. 2023;24(16).
45. Almeida BO, Machado-Neto JA. Emerging functions for ANKHD1 in cancer-related signaling pathways and cellular processes. BMB Rep. 2020;53(8):413-8.
46. Kitamata M, Hanawa-Suetsugu K, Maruyama K, Suetsugu S. Membrane-Deformation Ability of ANKHD1 Is Involved in the Early Endosome Enlargement. iScience. 2019;17:101-18.
47. Zhu M, Li X, Tian X, Wu C. Mask loss-of function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 2015;24(11):3272-85.
48. Kroll F, Powell GT, Ghosh M, Gestri G, Antinucci P, Hearn TJ, et al. A simple and effective F0 knockout method for rapid screening of behaviour and other complex phenotypes. Elife. 2021;10.
49. Gagnon JA, Valen E, Thyme SB, Huang P, Akhmetova L, Pauli A, et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 2014;9(5):e98186.
50. Talbot JC, Amacher SL. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 2014;11(6):583-5.
51. Moreno-Mateos MA, Vejnar CE, Beaudoin JD, Fernandez JP, Mis EK, Khokha MK, et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs Senior internship- 2nd master BMW for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nat Methods. 2015;12(10):982-8.
52. Labun K, Montague TG, Krause M, Torres Cleuren YN, Tjeldnes H, Valen E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic 2019;47(W1):W171-W4.
53. Acids Res. Vanoevelen JM, Bierau J, Grashorn JC, Lambrichs E, Kamsteeg EJ, Bok LA, et al. DTYMK is essential for genome integrity and neuronal survival. 2022;143(2):245-62.
54. Acta Neuropathol. Yalcin HC, Amindari A, Butcher JT, Althani A, Yacoub M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev Dyn. 2017;246(11):868-80.
55. J, Lang RM, Badano LP, Mor-Avi V, Afilalo Armstrong A, Ernande L, et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 2015;16(3):233-70.
56. Bernardo BC, Ooi JYY, McMullen JR. The yin and yang of adaptive and maladaptive processes in heart failure. Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies. 2012;9(4):e163-e72.
57. Valcarce DG, Selles-Egea A, Riesco MF, De Garnica MG, Martinez-Fernandez B, Herraez MP, et al. Early stress exposure on zebrafish development: effects on survival, malformations and molecular alterations. Fish Physiol Biochem. 2024;50(4):1545-62.
58. Haas J, Frese KS, Peil B, Kloos W, Keller A, Nietsch R, et al. Atlas of the clinical genetics of human dilated cardiomyopathy. Eur Heart J. 2015;36(18):1123-35a.
59. Chung CS, Hoopes CW, Campbell KS. Myocardial relaxation is accelerated by fast stretch, not reduced afterload. J Mol Cell Cardiol. 2017;103:65-73.
60. Lin SJ, Huang K, Petree C, Qin W, Varshney P, Varshney GK. Optimizing gRNA selection for high-penetrance F0 CRISPR screening for interrogating disease gene function. Nucleic Acids Res. 2025;53(5).
61. Shin JT, Pomerantsev EV, Mably JD, MacRae CA. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiol Genomics. 2010;42(2):300-9.
62. Vedder VL, Reinberger T, Haider SMI, Eichelmann L, Odenthal N, Abdelilah-Seyfried S, et al. pyHeart4Fish: Chamber-specific heart phenotype quantification of zebrafish in high content screens. 2023;11:1143852.
63. Front Cell Dev Biol. Barrionuevo WR, Burggren WW. O2 consumption and heart rate in developing zebrafish (Danio rerio): influence of temperature and ambient O2. Am J Physiol. 1999;276(2):R505-13.
64. Collymore C, Banks EK, Turner PV. Lidocaine Hydrochloride Compared with MS222 for the Euthanasia of Zebrafish (Danio rerio). J Am Assoc Lab Anim Sci. 2016;55(6):816-20.
