Virussen naar de fitness in de strijd tegen superbacteriën
Hoe zou een wereld zonder antibiotica eruitzien? Om deze vraag te beantwoorden hoeven we alleen naar het verleden kijken. Tot zo’n honderd jaar geleden was dit namelijk geen hypothetische vraag maar de werkelijkheid. Vandaag staan we er zelden bij stil, maar bacteriële infecties kunnen zeer gevaarlijk zijn. Voor de ontdekking van de antibiotica waren zulke infecties en niet kanker of hart- en vaatziekten de grootste doodsoorzaak wereldwijd. Je denkt nu misschien: gelukkig is deze tijd voorbij en zijn bacteriële infecties gemakkelijk te behandelen, maar is dat wel zo? Zijn we misschien te comfortabel geworden in de veronderstelling dat antibiotica altijd zullen werken? De realiteit is dat steeds meer bacteriën resistent worden tegen antibiotica waardoor antibioticaresistentie uitgroeit tot een van de grootste uitdagingen voor de volksgezondheid.
Het is natuurlijk niet mijn bedoeling om iemand hiermee angst aan te jagen en er is dan ook goed nieuws. Talloze wetenschappers onderzoeken namelijk alternatieve methoden om bacteriën te bestrijden. Een voorbeeld van zo’n methode en het onderwerp van mijn thesis is het gebruik van bacteriofagen (fagen in het kort). Dit zijn virussen die heel specifiek bacteriën aanvallen. Fagen inzetten voor het bestrijden van bacteriële infecties wordt ook wel faagtherapie genoemd. Voor het starten van zo’n therapie moet eerst een geschikte faag gezocht worden die efficiënt de infectie kan bestrijden, maar ik vroeg mij af of we niet een stap verder konden gaan. Wat als we fagen konden trainen om de gewenste bacteriën aan te vallen?
Hoe ziet zo’n faag eruit?
Wanneer iemand je vraagt hoe een virus eruitziet zal je waarschijnlijk denken aan virussen die mensen infecteren. Iedereen herinnert zich nog wel de beelden van het coronavirus: een bol met stekels verspreid over hun oppervlak. Fagen zien er echter volledig anders uit en zijn gekenmerkt door een kop, nek en staart. De staart bevat zogenaamde receptor-bindende proteïnen (RBPs) die verantwoordelijk zijn voor het herkennen van een bacteriële gastheer. Het zijn deze eiwitten die centraal stonden in mijn onderzoek en een vraag waarop ik een antwoord heb proberen vinden was hoe fagen hun RBPs kunnen evolueren om bacteriële infecties beter te bestrijden.
Moleculair knutselen
Ik ben tijdens mijn thesis het jaar begonnen met het maken van aangepaste fagen. Hierbij werden speciaal ontworpen RBPs toegevoegd aan een bestaande Klebsiella faag. Klebsiella is een pathogene bacterie die al vaak antibioticaresistentie vertoond en dus als prioriteit wordt gezien in de zoektocht naar alternatieve geneesmiddelen. Bij het ontwikkelen van een faagtherapie tegen een Klebsiella infectie is er echter een extra complexiteit. Deze bacterie bezit namelijk een “kapsel”, ofwel een beschermende mantel waarmee die zich kan verstoppen voor een faag. De oorzaak hiervan is de grote variëteit die bestaat in de samenstelling van de kapsels. Fagen kunnen met hun RBPs wel enkele kapselsamenstellingen herkennen, maar anderen blijven onaangeroerd.
Tijdens het ontwerp van de fagen werden RBPs gekozen die een defect hadden dat hun goede werking belemmerde. Dit klinkt misschien heel tegenstrijdig: waarom zouden we in een zoektocht naar sterkere fagen juist zwakkere produceren? De reden hiervoor is om te achterhalen hoe de fagen deze defecten kunnen overwinnen. Zo kan bepaald worden hoe we betere fagen kunnen maken.
Fagen in het fitnesscentrum
Vervolgens werd dus bekeken hoe de fagen zichzelf konden aanpassen om hun activiteit te herstellen. Hiervoor gebruikten we een techniek genaamd “directed evolution” of gestuurde evolutie. Daarbij wordt een omgeving gecreëerd waarin het voor de fagen interessant is om een op voorhand gekozen kenmerk te ontwikkelen. De fagen werden met andere woorden naar het fitnesscentrum gestuurd waar ik hun als persoonlijke trainer coachte om een specifiek doel te halen. Concreet betekende dit de fagen introduceren in een omgeving waarin voornamelijk Klebsiella met een specifiek kapsel aanwezig waren. Hierdoor ondervonden de fagen een evolutionair voordeel wanneer ze hun activiteit tegen die specifieke bacteriën verhoogden.
Mijn resultaten bewezen ook het succes van deze methode. Na slechts twee dagen trainen in het fitnesscentrum konden al fagen geïsoleerd worden die met meer succes dan hun voorgangers de gewenste bacteriën aanvielen. Van die fagen hebben we dan het DNA uitgelezen om ook te kunnen achterhalen hoe ze die kenmerken hadden verkregen, of in andere woorden welke mutaties ze hadden verzameld. DNA kan je je voorstellen als een lange sequentie van vier letters: A, T, C en G. Bij een mutatie wordt een deel van die sequentie aangepast en verandert dus het genetisch materiaal van de faag. In de geëvolueerde fagen vond ik voornamelijk twee soorten mutaties terug: puntmutaties waarbij één letter in de sequentie is aangepast, en recombinaties waarbij grotere delen van de sequenties van twee fagen zijn uitgewisseld.
Dit heeft ook geleid tot een interessante conclusie. Er werden namelijk verschillende fagen geëvolueerd. Enerzijds de originele fagen die de gewenste bacterie al konden aanvallen, en anderzijds de aangepaste fagen die dit nog niet konden. De eerste groep kon hun activiteit tegen de bacteriën verhogen met louter puntmutaties. De tweede groep daarentegen kon hun specificiteit enkel herstellen doormiddel van recombinaties.
Een lichtpunt voor de toekomst
De activiteit en kapselherkenning van fagen kan dus verhoogd worden door ze te trainen. Net als mensen kunnen fagen naar de fitness gaan om sterker te worden en hun tegenstander te verslaan. Er zit veel potentieel in deze getrainde fagen en hun verdere ontwikkeling kan er mee voor zorgen dat we de bacteriën een stapje voor blijven. Faagtherapie kan op die manier helpen voorkomen dat we terug terechtkomen in een wereld zonder antibiotica.
* Afbeelding verkregen van Servier Medical Art (https://smart.servier.com), gelicenctieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Bibliografie
Abedon, S. T. (2016). Phage therapy dosing: The problem(s) with multiplicity of infection (MOI). Bacteriophage, 6(3), e1220348. https://doi.org/10.1080/21597081.2016.1220348
Abedon, S. T., García, P., Mullany, P., & Aminov, R. (2017). Editorial: Phage Therapy: Past, Present and Future. Frontiers in Microbiology, Volume 8-2017. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00981
Abramson, J., Adler, J., Dunger, J., Evans, R., Green, T., Pritzel, A., Ronneberger, O., Willmore, L., Ballard, A. J., Bambrick, J., Bodenstein, S. W., Evans, D. A., Hung, C.-C., O’Neill, M., Reiman, D., Tunyasuvunakool, K., Wu, Z., Žemgulytė, A., Arvaniti, E., … Jumper, J. M. (2024). Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature, 630(8016), 493–500. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07487-w
Ackermann, H.-W. (2009). Phage Classification and Characterization. In Clokie, M.R., Kropinski, A.M. (Eds.), Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions (pp. 127–140). Humana Press. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-164-6_13
Barth, P.O., Wilhelm, C.M., Pereira, D.C., Antochevis, L.C., Martins, A.F., Barth, A.L. (2025). Use of IR Biotyper as a feasible methodology to type Klebsiella pneumoniae. Microbiology Spectrum, 13(11), e01146-25. https://doi.org/10.1128/spectrum.01146-25
Batinovic, S., Wassef, F., Knowler, S. A., Rice, D. T., Stanton, C. R., Rose, J., Tucci, J., Nittami, T., Vinh, A., Drummond, G. R., Sobey, C. G., Chan, H. T., Seviour, R. J., Petrovski, S., & Franks, A. E. (2019). Bacteriophages in Natural and Artificial Environments. Pathogens, 8(3), 100. https://doi.org/10.3390/pathogens8030100
Bodor, A., Bounedjoum, N., Vincze, G. E., Erdeiné Kis, Á., Laczi, K., Bende, G., Szilágyi, Á., Kovács, T., Perei, K., & Rákhely, G. (2020). Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, 19(1), 1–22. https://doi.org/10.1007/s11157-020-09522-4. https://link.springer.com/article/10.1007/s11157-020-09522-4
Boeckaerts, D., Stock, M., De Baets, B., & Briers, Y. (2022). Identification of Phage Receptor-Binding Protein Sequences with Hidden Markov Models and an Extreme Gradient Boosting Classifier. Viruses, 14(6), 1329. https://doi.org/10.3390/v14061329
Borges, A. L. (2021). How to train your bacteriophage. Proceedings of the National Academy of Sciences, 118(28), e2109434118. https://doi.org/10.1073/pnas.2109434118
Bull, J. J., Wichman, H. A., & Krone, S. M. (2022). Modeling the Directed Evolution of Broad Host Range Phages. Antibiotics, 11(12). https://doi.org/10.3390/antibiotics11121709
Burrowes, B. H., Molineux, I. J., & Fralick, J. A. (2019). Directed in Vitro Evolution of Therapeutic Bacteriophages: The Appelmans Protocol. Viruses, 11(3), 241. https://doi.org/10.3390/v11030241
Canchaya, C., Fournous, G., & Brüssow, H. (2004). The impact of prophages on bacterial chromosomes. Molecular Microbiology, 53(1), 9–18. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2004.04113.x
Chanishvili, N. (2012). Chapter 1 - Phage Therapy—History from Twort and d’Herelle Through Soviet Experience to Current Approaches. In Łobocka, M., Szybalski, W. (Eds.), Advances in Virus Research (Vol. 83, pp. 3–40). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-394438-2.00001-3
Church, N. A., & McKillip, J. L. (2021). Antibiotic resistance crisis: challenges and imperatives. Biologia, 76(5), 1535–1550. https://doi.org/10.1007/s11756-021-00697-x
Clokie, M. R., Millard, A. D., Letarov, A. V, & Heaphy, S. (2011). Phages in nature. Bacteriophage, 1(1), 31–45. https://doi.org/10.4161/bact.1.1.14942
Dams, D., Latka, A., Hulsens, M., Drulis-Kawa, Z., & Briers, Y. (2026). Modular plug-and-play engineering of Klebsiella phages with dual receptor-binding proteins for efficient host range design. Preprint (version 1). https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-8542153/v1
Djebara, S., Maussen, C., De Vos, D., Merabishvili, M., Damanet, B., Pang, K. W., De Leenheer, P., Strachinaru, I., Soentjens, P., & Pirnay, J.-P. (2019). Processing Phage Therapy Requests in a Brussels Military Hospital: Lessons Identified. Viruses, 11(3). https://doi.org/10.3390/v11030265
Drulis-Kawa, Z., Maciaszczyk-Dziubinska, E., & Bocer, T. (2009). Klebsiella phage KP32, complete genome. NCBI, NC_013647.1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_013647.1/
Durand, G. A., Raoult, D., & Dubourg, G. (2019). Antibiotic discovery: history, methods and perspectives. International Journal of Antimicrobial Agents, 53(4), 371–382. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2018.11.010
Effah, C. Y., Sun, T., Liu, S., & Wu, Y. (2020). Klebsiella pneumoniae: an increasing threat to public health. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 19(1), 1. https://doi.org/10.1186/s12941-019-0343-8. https://link.springer.com/article/10.1186/s12941-019-0343-8
El Haddad, L., Harb, C. P., Gebara, M. A., Stibich, M. A., & Chemaly, R. F. (2019). A Systematic and Critical Review of Bacteriophage Therapy Against Multidrug-resistant ESKAPE Organisms in Humans. Clinical Infectious Diseases, 69(1), 167–178. https://doi.org/10.1093/cid/ciy947
Eskenazi, A., Lood, C., Wubbolts, J., Hites, M., Balarjishvili, N., Leshkasheli, L., Askilashvili, L., Kvachadze, L., van Noort, V., Wagemans, J., Jayankura, M., Chanishvili, N., de Boer, M., Nibbering, P., Kutateladze, M., Lavigne, R., Merabishvili, M., & Pirnay, J.-P. (2022). Combination of pre-adapted bacteriophage therapy and antibiotics for treatment of fracture-related infection due to pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae. Nature Communications, 13(1), 302. https://doi.org/10.1038/s41467-021-27656-z. https://www.nature.com/articles/s41467-021-27656-z
Flint, J., Racaniello, V. R., Rall, G. F., Hatziioannou, T., & Skalka, A. M. (2020). Principles of Virology (5th ed., Vol. 2). ASM Press.
Follador, R., Heinz, E., Wyres, K. L., Ellington, M. J., Kowarik, M., Holt, K. E., & Thomson, N. R. (2016). The diversity of Klebsiella pneumoniae surface polysaccharides. Microbial Genomics, 2(8). https://doi.org/10.1099/mgen.0.000073
Fortier, L.-C., & Sekulovic, O. (2013). Importance of prophages to evolution and virulence of bacterial pathogens. Virulence, 4(5), 354–365. https://doi.org/10.4161/viru.24498
Foster, P. L. (2017). Mutation, Spontaneous☆. In Reference Module in Life Sciences. Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-809633-8.06768-6
Fuerst-Wilmes, M., Respondek, V., Schramm, M., Lilienthal, N., Buss, K., & Duechting, A. (2025). Regulation of phage therapy medicinal products: developments, challenges, and opportunities. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, Volume 15-2025. https://doi.org/10.3389/fcimb.2025.1631359
Gerstmans, H., Grimon, D., Gutiérrez, D., Lood, C., Rodríguez, A., van Noort, V., Lammertyn, J., Lavigne, R., & Briers, Y. (2020). A VersaTile-driven platform for rapid hit-to-lead development of engineered lysins. Science Advances, 6(23), eaaz1136. https://doi.org/10.1126/sciadv.aaz1136
Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R.-Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., & Smith, H. O. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343–345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
Gillespie, S. H. (1994). 7 - Gram-negative bacilli. In Gillespie, S.H. (Ed.), Medical Microbiology Illustrated (pp. 82–91). Butterworth-Heinemann. https://doi.org/10.1016/B978-0-7506-0187-0.50012-2
Gordillo Altamirano, F. L., & Barr, J. J. (2019). Phage Therapy in the Postantibiotic Era. Clinical Microbiology Reviews, 32(2), 10.1128/cmr.00066-18. https://doi.org/10.1128/cmr.00066-18
Górski, A., Międzybrodzki, R., Łobocka, M., Głowacka-Rutkowska, A., Bednarek, A., Borysowski, J., Jończyk-Matysiak, E., Łusiak-Szelachowska, M., Weber-Dąbrowska, B., Bagińska, N., Letkiewicz, S., Dąbrowska, K., & Scheres, J. (2018). Phage Therapy: What Have We Learned? Viruses, 10(6). https://doi.org/10.3390/v10060288
Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., & Ciofu, O. (2010). Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents, 35(4), 322–332. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2009.12.011
Housby, J. N., & Mann, N. H. (2009). Phage therapy. Drug Discovery Today, 14(11), 536–540. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.03.006
Jakob, N., Hammerl, J. A., Swierczewski, B. E., Würstle, S., & Bugert, J. J. (2025). Appelmans Protocol for in vitro Klebsiella pneumoniae phage host range expansion leads to induction of the novel temperate linear plasmid prophage vB_KpnS-KpLi5. Virus Genes, 61(1), 132–135. https://doi.org/10.1007/s11262-024-02124-0
Jdeed, G., Kravchuk, B., & Tikunova, N. V. (2025). Factors Affecting Phage–Bacteria Coevolution Dynamics. Viruses, 17(2). https://doi.org/10.3390/v17020235
Kasman, L. M., Kasman, A., Westwater, C., Dolan, J., Schmidt, M. G., & Norris, J. S. (2002). Overcoming the Phage Replication Threshold: a Mathematical Model with Implications for Phage Therapy. Journal of Virology, 76(11), 5557–5564. https://doi.org/10.1128/jvi.76.11.5557-5564.2002
Kęsik-Szeloch, A., Drulis-Kawa, Z., Weber-Dąbrowska, B., Kassner, J., Majkowska-Skrobek, G., Augustyniak, D., Łusiak-Szelachowska, M., Żaczek, M., Górski, A., & Kropinski, A. M. (2013). Characterising the biology of novel lytic bacteriophages infecting multidrug resistant Klebsiella pneumoniae. Virology Journal, 10(1), 100. https://doi.org/10.1186/1743-422X-10-100
Khasheii, B., Mahmoodi, P., & Mohammadzadeh, A. (2021). Siderophores: Importance in bacterial pathogenesis and applications in medicine and industry. Microbiological Research, 250, 126790. https://doi.org/10.1016/j.micres.2021.126790
Klumpp, J., Dunne, M., & Loessner, M. J. (2023). A perfect fit: Bacteriophage receptor-binding proteins for diagnostic and therapeutic applications. Current Opinion in Microbiology, 71, 102240. https://doi.org/10.1016/j.mib.2022.102240
Kupczok, A., Neve, H., Huang, K. D., Hoeppner, M. P., Heller, K. J., Franz, C. M. A. P., & Dagan, T. (2018). Rates of Mutation and Recombination in Siphoviridae Phage Genome Evolution over Three Decades. Molecular Biology and Evolution, 35(5), 1147–1159. https://doi.org/10.1093/molbev/msy027
Lam, M. M. C., Wick, R. R., Judd, L. M., Holt, K. E., & Wyres, K. L. (2022). Kaptive 2.0: updated capsule and lipopolysaccharide locus typing for the Klebsiella pneumoniae species complex. Microbial Genomics, 8(3). https://doi.org/10.1099/mgen.0.000800
Latka, A., Dams, D., Scholiers, L., Otwinowska, A., Olejniczak, S., Drulis-Kawa, Z., & Briers, Y. (2026a). Role of the C-terminal modules of Klebsiella phage KP32 receptor-binding protein gp38 in protein and phage functionality. PLOS Pathogens, 22(4), e1014106. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1014106
Latka, A., Dams, D., Scholiers, L., Van Mieghem, B., Drulis-Kawa, Z., & Briers, Y. (2026b). Cross-genus phage design through branching domain and conserved peptide interactions. Preprint, (version 1). https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-8669920/v1
Latka, A., Leiman, P. G., Drulis-Kawa, Z., & Briers, Y. (2019). Modeling the Architecture of Depolymerase-Containing Receptor Binding Proteins in Klebsiella Phages. Frontiers in Microbiology, Volume 10-2019. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02649
Latka, A., Lemire, S., Grimon, D., Dams, D., Maciejewska, B., Lu, T., Drulis-Kawa, Z., & Briers, Y. (2021). Engineering the Modular Receptor-Binding Proteins of Klebsiella Phages Switches Their Capsule Serotype Specificity. MBio, 12(3). https://doi.org/10.1128/mBio.00455-21
Lenchenko, E., Blumenkrants, D., Sachivkina, N., Shadrova, N., & Ibragimova, A. (2020). Morphological and adhesive properties of Klebsiella pneumoniae biofilms. Vet World, 13(1), 197–200. https://doi.org/10.14202/vetworld.2020.197-200
Lewis, K. (2012). Recover the lost art of drug discovery. Nature, 485(7399), 439–440. https://doi.org/10.1038/485439a
Li, Y., Kumar, S., Zhang, L., Wu, H., & Wu, H. (2023). Characteristics of antibiotic resistance mechanisms and genes of Klebsiella pneumoniae. Open Medicine, 18(1), 20230707. https://doi.org/10.1515/med-2023-0707
Linares, R., Arnaud, C.-A., Effantin, G., Darnault, C., Epalle, N. H., Boeri Erba, E., Schoehn, G., & Breyton, C. (2023). Structural basis of bacteriophage T5 infection trigger and E. coli cell wall perforation. Science Advances, 9(12), eade9674. https://doi.org/10.1126/sciadv.ade9674
Lister, S. A., & Barrow, P. (2008). Enterobacteriaceae. Poultry Diseases, 110–145. https://doi.org/10.1016/B978-0-7020-2862-5.50013-1
Loc-Carrillo, C., & Abedon, S. T. (2011). Pros and cons of phage therapy. Bacteriophage, 1(2), 111–114. https://doi.org/10.4161/bact.1.2.14590
Lossouarn, J., Beurrier, E., Bouteau, A., Moncaut, E., Sir Silmane, M., Portalier, H., Zouari, A., Cattoir, V., Serror, P., & Petit, M.-A. (2024). The virtue of training: extending phage host spectra against vancomycin-resistant Enterococcus faecium strains using the Appelmans method. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 68(5), e01439-23. https://doi.org/10.1128/aac.01439-23
Majkowska-Skrobek, G., Latka, A., Berisio, R., Squeglia, F., Maciejewska, B., Briers, Y., & Drulis-Kawa, Z. (2018). Phage-Borne Depolymerases Decrease Klebsiella pneumoniae Resistance to Innate Defense Mechanisms. Frontiers in Microbiology, 9, 2517. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02517
Martens, E., & Demain, A. L. (2017). The antibiotic resistance crisis, with a focus on the United States. The Journal of Antibiotics, 70(5), 520–526. https://doi.org/10.1038/ja.2017.30
Michniewski, S., Glenny, R., Kinsella, A., Porter, K., Wright, K., Harrison, S., Ugokwe, N. I., Alrashidi, A., Rashid, S., Eke, C., Lee, J. C., Patel, F., Josephs, T., Pedramfar, A., Coleman, M., Al-Dahash, H. F., Sabuholo, G. A., Roemer, N. S., Sampson, H., . . . Millard, A. (2026). Rolling out Plaque-2-seq: a single plaque sequencing approach enabling rapid, low-cost sequencing of phages directly from plaques. Microbial Genomics, 12(4). https://doi.org/10.1099/mgen.0.001672
Millardlab. (n.d.). Plaque-2-seq. Millardlab.Org. Retrieved June 4, 2026, from https://millardlab.org/plaque-2-seq/
Monteiro, A. de S. S., Cordeiro, S. M., & Reis, J. N. (2024). Virulence Factors in Klebsiella pneumoniae: A Literature Review. Indian Journal of Microbiology, 64(2), 389–401. https://doi.org/10.1007/s12088-024-01247-0. https://link.springer.com/article/10.1007/s12088-024-01247-0
Navon-Venezia, S., Kondratyeva, K., & Carattoli, A. (2017). Klebsiella pneumoniae: a major worldwide source and shuttle for antibiotic resistance. FEMS Microbiology Reviews, 41(3), 252–275. https://doi.org/10.1093/femsre/fux013
NCI. (n.d.). Definition of serotype - NCI Dictionary of Cancer Terms. Retrieved November 12, 2025, from https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/serotype
Nepal, R., Houtak, G., Wormald, P.-J., Psaltis, A. J., & Vreugde, S. (2022). Prophage: a crucial catalyst in infectious disease modulation. The Lancet Microbe, 3(3), e162–e163. https://doi.org/10.1016/S2666-5247(21)00354-2
Ngiam, L., Weynberg, K., & Guo, J. (2024). Evolutionary and co-evolutionary phage training approaches enhance bacterial suppression and delay the emergence of phage resistance. ISME Communications, 4(1), ycae082. https://doi.org/10.1093/ismeco/ycae082
Nobrega, F. L., Vlot, M., de Jonge, P. A., Dreesens, L. L., Beaumont, H. J. E., Lavigne, R., Dutilh, B. E., & Brouns, S. J. J. (2018). Targeting mechanisms of tailed bacteriophages. Nature Reviews Microbiology, 16(12), 760–773. https://doi.org/10.1038/s41579-018-0070-8
Otwinowska, A., Olejniczak, S., Latka, A., Pozniak, M., Majkowska-Skrobek, G., Maciejewska, B., Koszucki, J., Panicker, V. R., Jablonska, S., Hulsens, M., Stender, J., Niazi, M., Green, S., Bugert, J. J., Tournebize, R., Brouns, S. J. J., Squeglia, F., Berisio, R., Hammerl, J. A., … Drulis-Kawa, Z. (2026). DepoCatalog: mapping diversity of 129 recombinantly produced Klebsiella phage depolymerases. Nature Communications. https://doi.org/10.1038/s41467-026-73570-7
Paczosa, M. K., & Joan, M. (2016). Klebsiella pneumoniae: Going on the Offense with a Strong Defense. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 80(3), 629–661. https://doi.org/10.1128/mmbr.00078-15. https://journals.asm.org/doi/10.1128/mmbr.00078-15
Peters, T. L., Schow, J., Spencer, E., Van Leuven, J. T., Wichman, H., & Miller, C. (2024). Directed evolution of bacteriophages: thwarted by prolific prophage. Applied and Environmental Microbiology, 90(11), e00884-24. https://doi.org/10.1128/aem.00884-24
phagevalley. (n.d.). The Forgotten Belgian Bacteriophage Pioneers. Phagevalley.Com. Retrieved June 5, 2026, from https://phagevalley.com/history/
Philipson, C. W., Voegtly, L. J., Lueder, M. R., Long, K. A., Rice, G. K., Frey, K. G., Biswas, B., Cer, R. Z., Hamilton, T., & Bishop-Lilly, K. A. (2018). Characterizing Phage Genomes for Therapeutic Applications. Viruses, 10(4). https://doi.org/10.3390/v10040188
Pirnay, J.-P., Blasdel, B. G., Bretaudeau, L., Buckling, A., Chanishvili, N., Clark, J. R., Corte-Real, S., Debarbieux, L., Dublanchet, A., De Vos, D., Gabard, J., Garcia, M., Goderdzishvili, M., Górski, A., Hardcastle, J., Huys, I., Kutter, E., Lavigne, R., Merabishvili, M., … Van den Eede, G. (2015). Quality and Safety Requirements for Sustainable Phage Therapy Products. Pharmaceutical Research, 32(7), 2173–2179. https://doi.org/10.1007/s11095-014-1617-7
Pirnay, J.-P., Djebara, S., Steurs, G., Griselain, J., Cochez, C., De Soir, S., Glonti, T., Spiessens, A., Vanden Berghe, E., Green, S., Wagemans, J., Lood, C., Schrevens, E., Chanishvili, N., Kutateladze, M., de Jode, M., Ceyssens, P.-J., Draye, J.-P., Verbeken, G., … Donors, B. (2024). Personalized bacteriophage therapy outcomes for 100 consecutive cases: a multicentre, multinational, retrospective observational study. Nature Microbiology, 9(6), 1434–1453. https://doi.org/10.1038/s41564-024-01705-x. https://www.nature.com/articles/s41564-024-01705-x
Pirnay, J.-P., & Verbeken, G. (2023). Magistral Phage Preparations: Is This the Model for Everyone? Clinical Infectious Diseases, 77(Supplement_5), S360–S369. https://doi.org/10.1093/cid/ciad481
Pirnay, J.-P., Verbeken, G., Ceyssens, P.-J., Huys, I., De Vos, D., Ameloot, C., & Fauconnier, A. (2018). The Magistral Phage. Viruses, 10(2). https://doi.org/10.3390/v10020064
Podschun, R., & Ullmann, U. (1998). Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens: Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors. Clinical Microbiology Reviews, 11(4), 589–603. https://doi.org/10.1128/cmr.11.4.589
Privitera, M., Barra, G., Squeglia, F., Drulis-Kawa, Z., Napolitano, V., & Berisio, R. (2025). AI-Driven Structural Elucidation of the Bacteriophage KP32: Decoding Its Molecular Arsenal Against Klebsiella Pneumoniae. Frontiers in Bioscience Landmark, 30(11), 46489. https://doi.org/10.31083/FBL46489
Rohde, C., Resch, G., Pirnay, J.-P., Blasdel, B. G., Debarbieux, L., Gelman, D., Górski, A., Hazan, R., Huys, I., Kakabadze, E., Łobocka, M., Maestri, A., Almeida, G. M. de F., Makalatia, K., Malik, D. J., Mašlaňová, I., Merabishvili, M., Pantucek, R., Rose, T., … Chanishvili, N. (2018). Expert Opinion on Three Phage Therapy Related Topics: Bacterial Phage Resistance, Phage Training and Prophages in Bacterial Production Strains. Viruses, 10(4). https://doi.org/10.3390/v10040178
Russo, T. A., & Marr, C. M. (2019). Hypervirulent Klebsiella pneumoniae. Clinical Microbiology Reviews, 32(3), 10.1128/cmr.00001-19. https://doi.org/10.1128/cmr.00001-19
Sanjuán, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., & Belshaw, R. (2010). Viral Mutation Rates. Journal of Virology, 84(19), 9733–9748. https://doi.org/10.1128/jvi.00694-10
Shearwin, K. E., & Truong, J. Q. (2021). Lysogeny. In Bamford, D.H., Zuckerman, M. (Eds.), Encyclopedia of Virology (Fourth Edition) (pp. 77–87). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-809633-8.20963-1. https://www.sciencedirect.com/science/chapter/referencework/abs/pii/B9780128096338209631?via%3Dihub
Squeglia, F., Maciejewska, B., Łątka, A., Ruggiero, A., Briers, Y., Drulis-Kawa, Z., & Berisio, R. (2020). Structural and Functional Studies of a Klebsiella Phage Capsule Depolymerase Tailspike: Mechanistic Insights into Capsular Degradation. Structure, 28(6), 613-624.e4. https://doi.org/10.1016/j.str.2020.04.015
Stewart, P. S., & William Costerton, J. (2001). Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. The Lancet, 358(9276), 135–138. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(01)05321-1
Strathdee, S. A., Hatfull, G. F., Mutalik, V. K., & Schooley, R. T. (2023). Phage therapy: From biological mechanisms to future directions. Cell, 186(1), 17–31. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.11.017
Summers, W. C. (2017). Félix Hubert d’Herelle (1873–1949): History of a scientific mind. Bacteriophage, 6(4), e1270090. https://doi.org/10.1080/21597081.2016.1270090
Torriero-Smith, N., Rogers, B. A., McDonald, M. J., & Barr, J. J. (2026). Harnessing ‘phage training’ to bolster the therapeutic potential of bacteriophages. Current Opinion in Microbiology, 89, 102696. https://doi.org/10.1016/j.mib.2025.102696
Turner, D., Shkoporov, A. N., Lood, C., Millard, A. D., Dutilh, B. E., Alfenas-Zerbini, P., van Zyl, L. J., Aziz, R. K., Oksanen, H. M., Poranen, M. M., Kropinski, A. M., Barylski, J., Brister, J. R., Chanisvili, N., Edwards, R. A., Enault, F., Gillis, A., Knezevic, P., Krupovic, M., … Adriaenssens, E. M. (2023). Abolishment of morphology-based taxa and change to binomial species names: 2022 taxonomy update of the ICTV bacterial viruses subcommittee. Archives Of Virology, 168(2). https://doi.org/10.1007/s00705-022-05694-2. https://link.springer.com/article/10.1007/s00705-022-05694-2
Van Calck, J., Latka, A., & Briers, Y. (2025). Impact of genetic variations in Klebsiella pneumoniae bacteriophage protein KP32gp38 on capsule binding at protein and phage level. Ghent University.
Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., & Wade, W. G. (2010). Strategies for culture of ‘unculturable’ bacteria. FEMS Microbiology Letters, 309(1), 1–7. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2010.02000.x
Walker, K. A., & Miller, V. L. (2020). The intersection of capsule gene expression, hypermucoviscosity and hypervirulence in Klebsiella pneumoniae. Current Opinion in Microbiology, 54, 95–102. https://doi.org/10.1016/j.mib.2020.01.006
Williams, H. T. P. (2013). Phage-induced diversification improves host evolvability. BMC Evolutionary Biology, 13(1), 17. https://doi.org/10.1186/1471-2148-13-17
Wyres, K. L., Wick, R. R., Gorrie, C., Jenney, A., Follador, R., Thomson, N. R., & Holt, K. E. (2016). Identification of Klebsiella capsule synthesis loci from whole genome data. Microbial Genomics, 2(12). https://doi.org/10.1099/mgen.0.000102
Xiao, H., Tan, L., Tan, Z., Zhang, Y., Chen, W., Li, X., Song, J., Cheng, L., & Liu, H. (2023). Structure of the siphophage neck–Tail complex suggests that conserved tail tip proteins facilitate receptor binding and tail assembly. PLOS Biology, 21(12), e3002441-. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002441
Yehl, K., Lemire, S., Yang, A. C., Ando, H., Mimee, M., Torres, M. D. T., de la Fuente-Nunez, C., & Lu, T. K. (2019). Engineering Phage Host-Range and Suppressing Bacterial Resistance through Phage Tail Fiber Mutagenesis. Cell, 179(2), 459-469.e9. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.09.015
Yu, P., Mathieu, J., Li, M., Dai, Z., & Alvarez, P. J. J. (2016). Isolation of Polyvalent Bacteriophages by Sequential Multiple-Host Approaches. Applied and Environmental Microbiology, 82(3), 808–815. https://doi.org/10.1128/AEM.02382-15
Zampara, A., Sørensen, M. C. H., Grimon, D., Antenucci, F., Vitt, A. R., Bortolaia, V., Briers, Y., & Brøndsted, L. (2020). Exploiting phage receptor binding proteins to enable endolysins to kill Gram-negative bacteria. Scientific Reports, 10(1), 12087. https://doi.org/10.1038/s41598-020-68983-3
Zhang, M., Zhang, T., Yu, M., Chen, Y.-L., & Jin, M. (2022). The Life Cycle Transitions of Temperate Phages: Regulating Factors and Potential Ecological Implications. Viruses, 14(9). https://doi.org/10.3390/v14091904
Zhao, B., Chen, W., Ren, Y., Dai, L., Tang, C., Wang, X., Xie, L., Huang, Y., & Xiao, Y. (2025). Temporal trends of antibiotic resistance in culturable bacteria reveal the role of potential pathogens as pioneering carriers and resistance accumulators. Environment International, 202, 109692. https://doi.org/10.1016/j.envint.2025.109692
Zierke, L., Mourad, R., Kohler, T. P., Müsken, M., & Hammerschmidt, S. (2025). Influence of the polysaccharide capsule on virulence and fitness of Klebsiella pneumoniae. Frontiers in Microbiology, Volume 16-2025. https://doi.org/10.3389/fmicb.2025.1450984
