Structure based development of Plasmodium hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase inhibitors: a proof of concept study

Malaria uitroeien?

The battle continues

Elke minuut sterft een kind aan malaria. Ondanks grote inspanningen is dit nog steeds de verontrustende werkelijkheid. Bovendien raken de geneesmiddelen waarmee tegen malaria gestreden kan worden schaars. Heel veel malaria parasieten hebben immers resistentie ontwikkeld tegen de bestaande antimalaria geneesmiddelen. Enkel wanneer er blijvend geïnvesteerd wordt in de zoektocht naar nieuwe medicijnen kan malaria in de toekomst eventueel uitgeroeid worden.

De mug, het dodelijkste dier op aarde

Nee, niet de haai, de krokodil of de leeuw is het gevaarlijkste dier op aarde. Wel de malariamug. Elk jaar zorgt ze voor de dood van meer dan een half miljoen mensen, voornamelijk in ontwikkelingslanden (Bijlage 1). Malaria wordt veroorzaakt door de steek van een mug die geïnfecteerd is met de parasiet Plasmodium. Er zijn vijf Plasmodium soorten die de mens infecteren: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium knowlesi en Plasmodium malariae. Plasmodium falciparum en Plasmodium vivax zijn verantwoordelijk voor de meeste malaria gevallen en doden. Wanneer een geïnfecteerde mug een persoon steekt komt de parasiet in de bloedbaan terecht (Bijlage 2). Vervolgens reist Plasmodium via het bloed naar de lever waar hij zich een tijdje vestigt en zich vermeerderd. In een volgend stadium komen de parasieten opnieuw terecht in de bloedbaan en nestelen ze zich in de rode bloedcellen waarin ze  zich vervolgens snel gaan vermenigvuldigen. Dit gaat gepaard met vernietiging van de rode bloedcellen, bloedarmoede en hoge koortsaanvallen.

De DNA synthese van de parasiet aanvallen: een interessante antimalaria therapie

Tijdens de snelle groei in de rode bloedcellen is de DNA synthese van de parasiet erg actief. DNA bestaat uit twee verschillende bouwstenen: purines en pyrimidines. Mensen kunnen deze bouwstenen zelf aanmaken. Maar, zoals het een parasiet beaamt, maakt Plasmodium zijn purines niet zelf aan maar parasiteert hij zijn gastheer en maakt hij gebruik van diens purines. Om de opgenomen gastheerpurines vervolgens om te zetten in DNA en RNA moleculen heeft de parasiet een bepaald enzym absoluut nodig, namelijk hypoxanthine guanine fosforibosyltransferase, afgekort HGPRT. Enzymen kan je beschouwen als katalysatoren die reacties versnellen, in dit geval gastheer purine basen (hypoxanthine en guanine) omzetten in purine nucleotiden (IMP en GMP). Omdat dit enzym zo cruciaal is voor de groei en overleving van de parasiet is het een interessant antimalaria doelwit.

Ontwikkeling van HGPRT inhibitoren

Een aantal jaar geleden werd een samenwerking tussen de universiteiten van Queensland, Praag en Leuven tot stand gebracht met als doel inhibitoren te ontwikkelen die in staat zijn om het HGPRT enzym van de malariaparasiet te blokkeren. Dit leidde tot de ontwikkeling van zogenaamde acyclische nucleoside fosfonaten (ANP’s). Deze ANP’s lijken qua structuur sterk op de natuurlijke HGPRT nucleotide reactieproducten, IMP en GMP (Bijlage 3). Het enzym ziet geen verschil tussen de normale substraten en de ANP’s. Bijgevolg kunnen de ANP’s binden op de plaatsen die normaal worden ingenomen door de normale, natuurlijke substraten. Het gevolg is dat het enzym zijn normale functie verliest en geen purine nucleotiden meer kan aanmaken.

Het is reeds aangetoond dat ANP’s krachtige inhibitoren zijn van de menselijke, Plasmodium falciparum en Plasmodium vivax HGPRT enzymen in enzymstudies. In zulke studies wordt het enzym opgezuiverd en in oplossing gehouden. Vervolgens wordt bekeken hoe de activiteit van het enzym beïnvloed wordt in de aanwezigheid van de ANP’s. Deze studies zijn zeer nuttig maar ze vinden wel plaats in een artificiële omgeving die maar heel weinig op een normale cel of organisme lijkt. Daarom wordt ook getest of de ontwikkelde inhibitoren de groei van de parasiet kunnen remmen. Hierbij worden de producten toegevoegd aan rode bloedcellen die in het labo gekweekt worden en geïnfecteerd zijn met Plasmodium falciparum. Verschillende inhibitoren bleken inderdaad antimalaria activiteit te bezitten.

De ontwikkeling van een nieuwe HGPRT inhibitietest

De vraag die in mijn masterthesis gesteld werd is of de resultaten van de bovengenoemde studies aan elkaar gelinkt kunnen worden. Een malaria parasiet is immers een complex beestje en bezit zeer veel verschillende eiwitten die eventueel het doelwit zouden kunnen zijn van de HGPRT inhibitoren. Dit betekent dat je niet zomaar kunt concluderen dat de verminderde groei van de malaria parasieten in celcultuur het gevolg is van inhibitie van het HGPRT enzym. Daarom ontwikkelden wij een cellulaire assay die complementair is aan de enzym assay, waarbij opgezuiverd HGPRT onderzocht wordt in een celvrije omgeving en de Plasmodium falcicparum celcultuur assay, die replicatie van de gehele parasiet bestudeert.

Het eerste doel was om hoge expressieniveaus te verkrijgen van het HGPRT enzym in HGPRT-deficiënte cellen (cellen die zelf geen HGPRT aanmaken). Dit bereikten we met behulp van adenovirus vectoren waarin we de DNA sequenties plakten die de code vormen van de HGPRT enzymen (Bijlage 4). Adenovirus vectoren kunnen gezien worden als ‘gehandicapte’ virussen die in staat zijn om een cel te infecteren en hun genen tot expressie te brengen maar zich niet kunnen vermenigvuldingen en bijgevolg hun gastheercel niet doden zoals een volledig functioneel virus doet.

Vervolgens stelden we een radioactieve test op punt die het toelaat om de bekomen HGPRT enzymactiviteit te meten in de aan- en afwezigheid van inhibitoren. Met de door ons op punt gestelde test konden we aantonen dat drie rationeel ontworpen ANP’s inderdaad HGPRT inhiberen. Deze ANP’s zijn dus interessante moleculen voor de verdere onwikkeling tot antimalaria geneesmiddelen. Anderzijds stelden we ook vast dat een ANP die een zeer sterke inhibitor is in enzymstudies, geen inhibitie gaf van het HGPRT enzym in onze cellulaire assay. Deze resultaten tonen aan dat een combinatie van verschillende assays noodzakelijk is om de verschillende waarnemingen aan elkaar te linken.

Toekomstmuziek: HGPRT inhibitoren als anti-malaria medicijn

De door ons ontwikkelde test is complementair aan de reeds gebruikte assays en zal zeer nuttig zijn in het verdere verloop van dit project. Het ultieme doel is om HGPRT inhibitoren te ontwikkelen die selectief het HGPRT enzym van de malariaparasieten inhiberen maar een minimaal effect hebben op het menselijk enzym. Deze inhibitoren zouden in de toekomst een compleet nieuwe klasse van antimalaria geneesmiddelen kunnen worden en op die manier bijdragen aan de continue wapenwedloop tussen parasiet en onderzoeker.