Beïnvloedende factoren op weefselkwaliteit via RNA

Lichaamsmateriaal voor wetenschappelijk onderzoek! Dit kan meer inzicht leveren in het ontstaan van ziektes en hoe deze kunnen worden voorkomen. Dit onderzoek draagt bij aan de ontwikkeling van betere methoden, essentieel tot het stellen van betere behandelingswijzen, met de hieraan gekoppelde diagnose of prognose.

Om dit te achterhalen kunnen onderzoekers gebruik maken van gedoneerde dierlijke en menselijke stalen, zoals bloed, weefsels, urine, DNA, RNA enz. Het is van cruciaal belang om de kwaliteit van de stalen te behouden, voor verder klinisch- en biomedisch onderzoek. De kwaliteitsgarantie wordt bepaald door alle stappen en processen voorafgaande het uitvoeren van de eigenlijke analyses, met de hieraan inspelende factoren.

Jij, lezer, heeft u zich de volgende vragen al eens gesteld? Waar en hoe worden gedoneerde stalen bewaard? Hoe worden deze verwerkt? Welke factoren spelen een rol in de kwaliteit?

Laten we eerlijk zijn, wat zouden onderzoekers zijn/doen zonder hun donoren?!

Een bank met geld kent iedereen, maar een biobank?

In een biobank worden lichaamsmaterialen bewaard voor onbepaalde tijd, geschikt op elk moment voor onderzoek. Deze hebben als verantwoordelijkheid het collecteren, bewaren, verwerken en verdelen van biologisch materiaal en bijhorende data naar onderzoekscentra. Onderzoekers zijn in staat om de oorzaken, gevolgen, preventie, enz. van aandoeningen te achterhalen m.b.v. menselijke stalen.

Eén van de bekende biobanken uit België, is de ‘Bioresource center Ghent’. De centrale biobank van het Universitaire Ziekenhuis Gent. Hier wordt menselijk lichaamsmateriaal, alsook een beperkte hoeveelheid dierlijke materiaal, verwerkt en bewaard voor fundamenteel wetenschappelijk onderzoek naar klinisch onderzoek en omgekeerd. Momenteel worden hier ongeveer 290.000 klinische stalen uit verschillende onderzoeksdomeinen bewaard.

Belangrijke aspecten

Geen zin in gehakt vanavond? “Ik bewaar het in de diepvries”.

Ook voor donatiestalen in biobanken is de manier van bewaren belangrijk. Zo spelen de gebruikte bewaringsrecipiënten, invriesmethoden, tijdstippen een rol in het kwaliteitsbehoud.

Als bewaringsrecipiënten worden alucups (invriespotten) en cryovials (kleine polypropyleenbuizen) gebruikt, beide bestand tegen extreem lage temperaturen tot -196°C. Verder vindt de bewaring van de stalen plaats in diepvriezen (-20°C, -35°C, -80°C) en in stikstofvaten (-196°C).

Om de kwaliteit verder te garanderen kan men de stalen traag of snel invriezen. Bij traag invriezen zullen de stalen geleidelijk aan afkoelen m.b.v. een Coolcell™, waarbij de temperatuur daalt met 1°C per minuut. Tijdens snel invriezen wordt het weefsel bij een lage temperatuur (tussen -80°C en -196°C) op een korte periode ingevroren. De meest gebruikte standaardprocedure is snel invriezen met isopentaan in combinatie met droogijs (-80°C) of vloeibare stikstof (-196°C).

In dit onderzoek wordt er gefocust op een kwaliteitsbeoordeling van RNA. RNA is heel lijkend op DNA maar minder stabiel. Hierdoor kunnen snellere veranderingen in de kwaliteit worden waargenomen. In alle lichaamscellen zit erfelijk informatie opgeslagen, dat in DNA-vorm gebeurt. RNA speelt een belangrijke rol in het coderen, overbrengen, reguleren, interpreteren en tot expressie komen van genen.

Joepie, we hebben een onderzoeksdoel!

Achterhalen wat de vriesimpact is van de verschillende pre-analytische variabelen (PAV) op weefsel. Men onderzoekt welk weefselgrootte, invriestijdstip en invriesmethode de beste weefselkwaliteit opleveren.

Eindelijk, men kan beginnen

Voor een brede scala aan data, werd het onderzoek uitgevoerd op dierlijk varkensweefsel. Via dissectie werden long- en leverweefsel gepreleveerd.

In onderstaande tabel: long- en leverweefsel werden versneden en ingevroren via verschillende invriesmethoden, groottes en op drie tijdstippen.

Op alle stukken weefsel wordt een manuele RNA–extractie uitgevoerd aan de hand van een TRI Reagent-protocol. Via het toestel 2100 BioAnalyzer van Agilent, wordt RNA-integriteit nummer (RIN-score) verkregen die de kwaliteit van het totaal RNA weergeeft. Alsook wordt de optische densiteit (OD) ratio bepaald via spectrofotometrie, wat iets meer zegt over de zuiverheid.

Het geïsoleerde RNA kan verder worden gebruikt voor verschillende downstream toepassingen, inclusief real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), amplificatie voor array-analyses, hybridisatiebepalingen of translatie in vitro.

Resultaten en discussie

PAV 1: weefselgrootte

De RNA-concentraties zijn bij de long, in tegenstelling tot bij de lever, over het algemeen hoger voor alucup dan voor cryovial. Mogelijks kan dit wijzen op betere kwaliteit van het weefsel in de alucups. Een andere mogelijkheid is dat het invriezen in verschillende weefselgroottes weefselafhankelijk is.

Voor beide weefsels worden betere RIN-scores verkregen bij alucup. Ook scoren de OD-ratio’s over de hele lijn goed.

PAV 2: Invriestijdstippen

Wanneer de RIN-scores van de 3 tijdstippen met elkaar vergeleken worden bij beide weefsels, ziet men een lichte daling naarmate de tijd tussen prelevatie en invriezen toeneemt. Er zal een betere RNA-kwaliteit worden verkregen bij een kortere koude ischemie tijd (KIT). De KIT is de tijd tussen weefselafname en invriezen.

PAV 3: Invriesmethoden

We zien voor de long bij zowel de alucup als de cryovial, dat de hoogste RNA-concentraties worden bekomen bij het gebruik van droogijs. De concentraties bij IV1 en IV2 zijn gelijkaardig of hoger dan bij IV3 en IV4. Dit valt niet binnen onze verwachtingen, want invriezen met vloeibare stikstof in combinatie met isopentaan wordt beschreven als de norm.

Voor de lever bij de alucup zien we dat vloeibare stikstof in combinatie met isopentaan de hoogste RNA-concentraties oplevert. Bij de cryovial is er geen duidelijke trend waarneembaar. Dit is volgens onze verwachtingen, aangezien vloeibare stikstof in combinatie met isopentaan wordt beschreven als de norm. Wat zal leiden tot minder weefsel- en RNA-degradatie.

Besluit

Uit dit onderzoek kunnen we besluiten dat een kleinere weefselgrootte bij een zo kort mogelijke koude ischemietijd de beste RNA-kwaliteit oplevert. Uit de bekomen OD-ratio blijkt dat bij alle PAV zuiver RNA wordt verkregen. Ook worden over het algemeen goede RIN-scores bekomen, wat wijst op goede RNA-kwaliteit. Echter werd bij alle onderdelen slechts een minimale hoeveelheid data verkregen. Omwille van deze reden is het aangeraden om verder onderzoek uit te voeren. Alsook is het aanbevolen om andere condities te onderzoeken, zoals andere tijdstippen, groottes enz. om de reproduceerbaarheid na te gaan.

Ben je een onderzoeker? Wordt een echte wetenschapper en voer dit onderzoek uit op uw manier en met de aanbevolen suggesties!