Optimalisatie van een detectiemethode voor hepatitis E in varkenslever
Het hepatitis E virus (HEV) veroorzaakt leverontsteking, net als de andere vijf hepatitis virussen (A, B, C, D en G). Het verschil zit vooral in de besmettingsroute, de klachten en de ernst van de ziekte. Zo kan HEV overgedragen worden van dier op mens via 3 verschillende wegen namelijk via fecaal-orale weg, via besmette levensmiddelen of via transfusie en bloeddonatie. Momenteel is HEV infectie moeilijk te behandelen maar de overdracht van het virus kan wel voorkomen worden.
De opzet van dit onderzoek is het optimaliseren van een detectiemethode voor HEV op basis van qPCR naar aanleiding van groeiende bezorgdheid over de overdracht van HEV via besmette levensmiddelen en in het bijzondere varkenslever.
In een eerste fase wordt de qPCR-detectiemethode geoptimaliseerd uitgaande van 3 methoden die beschreven zijn in de literatuur. Hierbij worden primer- en probecombinaties met bijhorende qPCR-programma’s getest gebruikmakend van een HEV-gBlock fragment (= synthetisch DNA fragment dat een gedeelte van het HEV-genoom bevat). Hieruit is gebleken dat met de primer- en probecombinatie beschreven door Pas et al [1] de beste resultaten worden bekomen. Deze primer- en probecombinatie met bijhorende qPCR-programma is geselecteerd voor gebruik in verdere analyses. Als procescontrole wordt gebruik gemaakt van het murine norovirus waarvoor ook een primer- en probecombinatie met bijhorend qPCR-programma beschreven door Stals et al [2] getest wordt met behulp van het MNV-1 gBlock fragment.
Vervolgens wordt de reverse transcriptie stap of cDNA-synthese geoptimaliseerd aan de hand van het WHO HEV RNA referentiemateriaal. Dit referentiemateriaal wordt in verschillende verdunningen en hoeveelheden getest in de mastermix. De resultaten bekomen met 1 µl onverdund referentiemateriaal verschillen heel weinig met de te verwachte waarden waarbij besloten wordt om hiermee verder te werken telkens als controle voor de cDNA-synthese.
In een derde fase wordt de RNA-extractie gebruikmakend van de RNeasy Mini kit (Qiagen) getest aan de hand van humaan HEV positieve faecessuspensie en het murine norovirus lysaat waarvan de concentraties geschat zijn op ongeveer 9 log RNA kopijen/ml. De bekomen concentraties liggen in dezelfde grootteorde als de te verwachten concentraties.
In een laatste stap worden varkensleverstalen beënt met humaan HEV positieve faecessuspensie en murine norovirus lysaat. Het virus wordt vervolgens geconcentreerd volgens een protocol gebaseerd op het standaardprotocol van Wageningen bioveterinary research. Hierna wordt RNA geëxtraheerd, cDNA bereid en qPCR uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Door vergelijking van het aantal gedetecteerde genomische kopijen met het aantal beënte wordt er een besluit getrokken over het verloop van het volledige proces.
