De invloed van hemolymfe van bijenlarven op de expressie van potentiële virulentiegenen van Paenibacillus larvae

Sarah

Van Lent

Bijensterfte: goed of slecht nieuws?

Berichten over massale bijensterfte duiken al enige tijd regelmatig op in het nieuws. De reacties daarop lopen sterk uiteen. Mensen die geen onderscheid maken tussen bijen en wespen, vinden dat waarschijnlijk een goede zaak. Wie wel het verschil kent, stelt zich terecht vragen. Bijen vervullen immers een zeer belangrijke rol in de bestuiving van zaadplanten en vormen op die manier een onmisbare schakel in onze voedselketen. Het is van het hoogste belang de verschillende oorzaken van de bijensterfte te achterhalen en uit te schakelen. In mijn thesis bestudeerde ik de bacterie die Amerikaans vuilbroed verwekt, een ziekte die larven van de bijen aantast.

Bestuiving is een biologisch proces waarbij stuifmeelkorrels uit de helmhokjes van de meeldraden overgebracht worden naar de stempel van de stamper. Dit proces is noodzakelijk om de plant te bevruchten, waarna nieuwe vruchten (bv. fruit) gevormd worden. Bestuiving kan zowel volbracht worden door dieren (o.a. insecten en vogels) als door de wind of door water. Bij veel voedselgewassen (vnl. groenten en fruit) en wilde planten gebeurt de bestuiving door dieren. De insecten hebben daarin het grootste aandeel. De economische waarde van de bestuiving van gewassen door insecten bedraagt ongeveer 153 miljard euro. Aangezien dat 10% is van de waarde van de wereldvoedselproductie, zijn bestuivende insecten van levensbelang voor de menselijke voedselvoorziening. Van de insecten zijn de bijen wereldwijd de belangrijkste bestuivers. Zij zijn immers voor hun voeding volledig afhankelijk van bloemen, waardoor ze dus heel veel bloemen bezoeken en tegelijkertijd voor bestuiving zorgen. Het stuifmeel is namelijk de eiwit- en mineralenbron voor de bij, terwijl de nectar hun suikerbron is.

Het succes van bijen is mede te danken aan hun grote aantallen, een strikte taakverdeling en een goede communicatie. Met velen samenleven op een kleine plaats leidt echter tot een groot risico op infectie. De pathogeen (o.a. bacteriën en virussen) kan zich namelijk gemakkelijk verspreiden en zo tot grote economische verliezen leiden. Immers, minder bijen betekent minder bestuiving en dus minder opbrengst in o.a. land- en tuinbouw. Kennis over de manier waarop pathogenen de gezondheid van de bij aantasten is essentieel om de ziekten te kunnen behandelen en/of te voorkomen. Mijn thesis kadert binnen een doctoraat dat o.a. de virulentiegenen van Paenibacillus larvae wil identificeren. Deze bacterie is de verwekker van Amerikaans vuilbroed, een ziekte die leidt tot sterfte van de larven van de bij. Wanneer virulentiegenen aangezet worden leiden ze tot de productie van virulentiefactoren en dat zijn bv. toxines, adhesines (belangrijk voor de vasthechting van de pathogeen aan de gastheer). De pathogeen maakt gebruik van die virulentiefactoren om ziekte te veroorzaken. De identificatie van de virulentiegenen is een eerste belangrijke stap in de zoektocht naar controle- en behandelingsmethoden van Amerikaans vuilbroed.

Het genoom van P. larvae is sinds kort gekend. Met behulp van bio-informatica analyses werden meer dan 200 mogelijke virulentiegenen geïdentificeerd. Dit is echter slechts een voorspelling en d.m.v. labo experimenten moet nagegaan worden of deze genen inderdaad een rol spelen bij de infectie van larven van de bij. Er zijn reeds verschillende studies gekend, waarbij men virulentiegenen van pathogenen geïdentificeerd heeft, doordat ze sterker of zwakker aangezet werden in de aanwezigheid van gastheerweefsels. In geval van P. larvae betekent dit dat de virulentiegenen sterker of zwakker aangezet worden in de aanwezigheid van hemolymfe (= bloed) van bijenlarven, aangezien dit een gastheerweefsel is voor P. larvae.

Kwantitatieve PCR (Q-PCR) en micro-arrays worden meer en meer gebruikt om na te gaan of genen sterker of zwakker aangezet worden in verschillende condities. Met behulp van micro-arrays kan van duizenden genen (bv. al de genen van P. larvae) tegelijkertijd bepaald worden hoe sterk of zwak ze aanstaan. Q-PCR daarentegen bepaalt hoe sterk of zwak een beperkt aantal genen aanstaat. Deze techniek is nauwkeuriger dan micro-array. Een micro-array analyse geeft snel een indicatie van welke genen sterker of zwakker aanstaan in aanwezigheid van hemolymfe en met Q-PCR kan je nadien nauwkeurig bepalen hoeveel het gen meer of minder aanstaat. Een micro-array experiment is echter duur en daarom hebben we besloten om eerst de optimale condities voor het micro-array experiment na te gaan met een Q-PCR experiment. Q-PCR werd nu dus uitzonderlijk ook voor het micro-array experiment reeds gebruikt en zal ook na het micro-array experiment gebruikt worden om exact te bepalen hoeveel sterker of zwakker de genen aanstaan.

Ten eerste heb ik een antwoord gezocht op een aantal essentiële vragen waaronder o.a.:

In welk vloeibaar medium (J-, BHIT- of MYPGP- medium) groeit P. larvae het best? Deze media hebben een verschillende samenstelling van voedingsstoffen. Afhankelijk van welke voedingsstoffen P. larvae het best kan gebruiken, zal de bacterie beter groeien in het ene medium t.o.v. het andere.
Hoeveel uur nadat we hemolymfe toegevoegd hebben aan de bacteriecultuur, zullen we bepalen hoe sterk de mogelijke virulentiegenen aanstaan?

Nadat ik een antwoord gevonden had op deze en nog meer vragen, waren de condities voor het Q-PCR experiment gekend. We besloten om P. larvae te groeien in BHIT-medium en nadat de bacterie voldoende gegroeid was, werd de cultuur in twee gesplitst. Vervolgens werd aan één cultuur hemolymfe en aan de andere PTU (de controlecultuur) toegevoegd. Dit houdt in dat beide culturen identiek waren, het enige verschil was de aan- of afwezigheid van hemolymfe. Een verschil in de sterkte waarin de genen aanstonden, is dus uitsluitend het gevolg van hemolymfe. Eén uur, 3 uur en 9 uur na het toevoegen van hemolymfe en PTU werd er een staal genomen van beide bacterieculturen. D.m.v. Q-PCR werd bepaald hoe sterk de tien mogelijke virulentiegenen op de drie tijdstippen aanstonden.

Ondanks dat slechts een klein aantal mogelijke virulentiegenen getest werden in deze studie (slechts 10 van de meer dan 200), werd toch een duidelijk verschil vastgesteld in de mate waarin de genen aanstonden in aan- en afwezigheid van hemolymfe (na 1 uur stonden vijf genen minder sterk aan in de aanwezigheid van hemolymfe en één gen stond sterker aan; na 3 uur stond één gen minder sterk aan en drie genen stonden sterker aan; na 9 uur stond geen enkel gen minder sterk aan en vijf genen stonden sterker aan). Aangezien de gebruikte omstandigheden (gekozen medium, tijdstippen, ...) leidden tot een verschil in de mate waarin de onderzochte genen aanstonden, was de conclusie van mijn thesis dat deze condities ook gebruikt kunnen worden voor de micro-array analyse die in de toekomst uitgevoerd zal worden.

Bibliografie

Boeken:

Hoff M. Pollination. First edition. Minnesota: Creative Education; 2004.
Madigan MT, Martinko JM. Brock biology of microorganisms. Eleventh edition. U.S.: Pearson; 2006.
White GF. The Bacteria of the Apiary, with Special Reference to Bee Diseases. Technical Series No. 14.
Washington DC: U.S. Department of Agriculture, Bureau of Entomology; 1906.
Winston ML. The Biology of the Honey Bee. First edition. Cambridge: Harvard University Press; 1991.

Websites:

[1] http://www.konvib.eu/
[2] http://www.uniprot.org/taxonomy/1464
[3] http://www.bioconductor.org/help/course-materials/2009/EMBLJune09/Talks…
[4] http://bioinformatics.psb.ugent.be/courses/ggs/bioinformatics_yves/onli…
[5] https//www.msu.edu/~debruijn/
[6] http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi.

Artikels

Alippi AM, Albo GN, Reynaldi FJ, De Giusti MR (2005) In vitro and in vivo susceptibility of the honeybee bacterial pathogen Paenibacillus larvae subsp larvae to the antibiotic tylosin. Veterinary Microbiology 109(1-2): 47-55
Alippi AM, Lopez AC, Reynaldi FJ, Grasso DH, Aguilar OM (2007) Evidence for plasmid-mediated tetracycline resistance in Paenibacillus larvae, the causal agent of American Foulbrood (AFB) disease in honeybees. Veterinary Microbiology 125(3-4): 290-303
Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF (2004) Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res 64(15): 5245-5250
Antunez K, Harriet J, Gende L, Maggi M, Eguaras M, Zunino P (2008) Efficacy of natural propolis extract in the control of American Foulbrood. Veterinary Microbiology 131(3-4): 324-331
Antunez K, Piccini C, Castro-Sowinski S, Rosado AS, Seldin L, Zunino P (2007) Phenotypic and genotypic characterization of Paenibacillus larvae isolates. Vet Microbiol 124(12): 178-183
Ashiralieva A, Genersch E (2006) Reclassification, genotypes and virulence of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American foulbrood in honeybees - a review. Apidologie 37(4): 411-420
Bastos EMAF, Simone M, Jorge DM, Soares AEE, Spivak M (2008) In vitro study of the antimicrobial activity of Brazilian propolis against Paenibacillus larvae. Journal of Invertebrate Pathology 97(3): 273-281
Blacquière T (2009) Visie Bijenhouderij en Insectenbestuiving. pdf informatiebrochure 1-58
Capestany CA, Tribble GD, Maeda K, Demuth DR, Lamont RJ (2008) Role of the Clp system in stress tolerance, Biofilm formation, and intracellular invasion in Porphyromonas gingivalis. Journal of Bacteriology 190(4): 1436-1446
Cerenius L, Babu R, Soderhall K, Jiravanichpaisal P (2010) In vitro effects on bacterial growth of phenoloxidase reaction products. Journal of Invertebrate Pathology 103(1): 21 23
Cerenius L, Lee BL, Soderhall K (2008) The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trends in Immunology 29(6): 263-271
Chan QW, Melathopoulos AP, Pernal SF, Foster LJ (2009) The innate immune and systemic response in honey bees to a bacterial pathogen, Paenibacillus larvae. BMC Genomics 10: 387
Chan QWT, Cornman RS, Birol I, Liao N, Chan S, Docking R, Taylor G, Jones SJM, de Graaf DC, Evans JD, Foster LJ. (submitted) Updated genome assembly and annotation of Paenibacillus larvae, the agent of American foulbrood disease of honey bees.
Chan QWT, Foster LJ (2008) Changes in protein expression during honey bee larval development. Genome Biology 9(10): -
Cornelissen B, van der Steen S, Blacquière T. De broedziekten van honingbijen, herkenning en bestrijding. pdf
informatiebrochure broedziekten, pp. 1-15.
Dancer BN, Chantawannakul P (1997) The proteases of American foulbrood scales. Journal of Invertebrate Pathology 70(2): 79-87
Davidson EW (1970) Ultrastructure of perithrophic membrane development in larvae of the worker honey bee (Apis mellifera). Journal of Invertebrate Pathology 15: 53-61
de Graaf DC, Alippi AM, Brown M, Evans JD, Feldlaufer M, Gregorc A, Hornitzky M, Pernal SF, Schuch DM, Titera D, Tomkies V, Ritter W (2006a) Diagnosis of American foulbrood in honey bees: a synthesis and proposed analytical protocols. Lett Appl Microbiol 43(6): 583-590
Dingman DW, Stahly DP (1983) Medium Promoting Sporulation of Bacillus-Larvae and Metabolism of Medium Components. Applied and Environmental Microbiology 46(4): 860-869
Dobbelaere W, de Graaf DC, Peeters JE, Jacobs FJ (2001) Development of a fast and reliable diagnostic method for American foulbrood disease (Paenibacillus larvae subsp larvae) using a 16S rRNA gene based PCR. Apidologie 32(4): 363-370
Drevinek P, Holden MTG, Ge ZP, Jones AM, Ketchell I, Gill RT, Mahenthiralingam E (2008) Gene expression changes linked to antimicrobial resistance, oxidative stress, iron depletion and retained motility are observed when Burkholderia cenocepacia grows in cystic fibrosis sputum. Bmc Infectious Diseases 8
Evans JD (2004) Transcriptional immune responses by honey bee larvae during invasion by the bacterial pathogen, Paenibacillus larvae. J Invertebr Pathol 85(2): 105-111
Evans JD, Armstrong TN (2006) Antagonistic interactions between honey bee bacterial symbionts and
implications for disease. BMC Ecol 6: 4
Evans JD, Pettis JS (2005) Colony-level impacts of immune responsiveness in honey bees, Apis mellifera. Evolution 59(10): 2270-2274
Figueiredo MD, Salter CE, Andrietti AL, Vandenplas ML, Hurley DJ, Moore JN (2009) Validation of a reliable set of primer pairs for measuring gene expression by real-time quantitative RT-PCR in equine leukocytes. Vet Immunol Immunopathol 131(1-2): 65-72
Frees D, Qazi SNA, Hill PJ, Ingmer H (2003) Alternative roles of ClpX and ClpP in Staphylococcus aureus stress tolerance and virulence. Molecular Microbiology 48(6): 1565-1578
Fries I, Lindstrom A, Korpela S (2006) Vertical transmission of American foulbrood (Paenibacillus larvae) in honey bees (Apis mellifera). Vet Microbiol 114(3-4): 269-274
Fünfhaus A, Borriss, Genersch (2009) Use of suppression subtractive hybridization to identify genetic differences between differentially virulent genotypes of Paenibacillus larvae, the etiological agent of Americal Foulbrood of honeybees. Environmental Microbiology Reports 1: 240-250
Gaillot O, Pellegrini E, Bregenholt S, Nair S, Berche P (2000) The ClpP serine protease is essential for the intracellular parasitism and virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology 35(6): 1286-1294
Gallai N, Salles JM, Settele J, Vaissiere BE (2009) Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecological Economics 68(3): 810-821
Genersch E (2008) Paenibacillus larvae and American Foulbrood - long since known and still surprising. Journal of Consumer Protection and Food Safety 3: 429-434
Genersch E (2010) American Foulbrood in honeybees and its causative agent, Paenibacillus larvae. J Invertebr Pathol 103 Suppl 1: S10-19
Genersch E, Ashiralieva A, Fries I (2005) Strain- and genotype-specific differences in virulence of Paenibacillus larvae subsp. larvae, a bacterial pathogen causing American foulbrood disease in honeybees. Appl Environ Microbiol 71(11): 7551-7555
Genersch E, Forsgren E, Pentikainen J, Ashiralieva A, Rauch S, Kilwinski J, Fries I (2006) Reclassification of Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsp. larvae as Paenibacillus larvae without subspecies differentiation. Int J Syst Evol Microbiol 56(Pt 3): 501-511
Gochnauer TA (1973) Growth, Protease Formation, and Sporulation of Bacillus-Larvae in Aerated Broth Culture. Journal of Invertebrate Pathology 22(2): 251-257
Hacker J, Blum-Oehler G, Muhldorfer I, Tschape H (1997) Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. Mol Microbiol 23(6): 1089-1097
Hansen H, Brodsgaard CJ (1999) American foulbrood: a review of its biology, diagnosis and control. Bee World 80: 5-23
Heyndrickx M, Vandemeulebroecke K, Hoste B, Janssen P, Kersters K, De Vos P, Logan NA, Ali N, Berkeley RC (1996) Reclassification of Paenibacillus (formerly Bacillus) pulvifaciens (Nakamura 1984) Ash et al. 1994, a later subjective synonym of Paenibacillus (formerly Bacillus) larvae (White 1906) Ash et al. 1994, as a
subspecies of P. larvae, with emended descriptions of P. larvae as P. larvae subsp. larvae and P. larvae subsp. pulvifaciens. Int J Syst Bacteriol 46(1): 270-279
Hornitzky M (1998) The pathogenicity of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores and vegetative cells to honey bee (Apis mellifera) colonies and their susceptibility to royal jelly. Journal of Apicultural Research 37: 267-271
Hornitzky MAZ, Nicholls PJ (1993) J-Medium Is Superior to Sheep Blood Agar and Brain Heart Infusion Agar for the Isolation of Bacillus-Larvae from Honey Samples. Journal of Apicultural Research 32(1): 51-52
Hornitzky MAZ, Wilson SC (1989) A System for the Diagnosis of the Major Bacterial Brood Diseases of
Honeybees. Journal of Apicultural Research 28(4): 191-195
Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A (2005) Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes and Immunity 6(4): 279-284
Jain M, Nijhawan A, Tyagi AK, Khurana JP (2006) Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications 345(2): 646-651
Jandu N, Ho NKL, Donato KA, Karmali MA, Mascarenhas M, Duffy SP, Tailor C, Sherman PM (2009) Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Gene Expression Profiling in Response to Growth in the Presence of Host Epithelia. Plos One 4(3):
Jian B, Liu B, Bi YR, Hou WS, Wu CX, Han TF (2008) Validation of internal control for gene expression study in soybean by quantitative real-time PCR. Bmc Molecular Biology 9:
Julian GS, Bulla LA, Jr. (1971) Physiology of sporeforming bacteria associated with insects. IV. Glucose catabolism in Bacillus larvae. J Bacteriol 108(2): 828-834
Kar NP, Sikriwal D, Rath P, Choudhary RK, Batra JK (2008) Mycobacterium tuberculosis ClpC1. Febs Journal 275(24): 6149-6158
Katznelson H (1950) Bacillus pulvifaciens (N. SP.), an organism associated with powdery scale of honeybee larvae. J Bacteriol 59(2): 153-155
Keller NP, Turner G, Bennett JW (2005) Fungal secondary metabolism - From biochemistry to genomics. Nature Reviews Microbiology 3(12): 937-947
Kochansky A, Pettis J (2005) Screening additional antibiotics for efficacy against American foulbrood. Journal of Apicultural Research 44(1): 24-28
Kojetin DJ, McLaughlin PD, Thompson RJ, Dubnau D, Prepiak P, Rance M, Cavanagh J (2009) Structural and Motional Contributions of the Bacillus subtilis ClpC N-Domain to Adaptor Protein Interactions. Journal of Molecular Biology 387(3): 639-652
Kruger E, Witt E, Ohlmeier S, Hanschke R, Hecker M (2000) The Clp proteases of Bacillus subtilis are directly involved in degradation of misfolded proteins. Journal of Bacteriology 182(11): 3259-3265
Lee H, Churey JJ, Worobo RW (2009) Isolation and characterization of a protective bacterial culture isolated from honey active against American Foulbrood disease. Fems Microbiology Letters 296(1): 39-44
Lindstrom A, Korpela S, Fries I (2008a) The distribution of Paenibacillus larvae spores in adult bees and honey and larval mortality, following the addition of American foulbrood diseased brood or spore-contaminated honey in honey bee (Apis mellifera) colonies. Journal of Invertebrate Pathology 99(1): 82-86
Lindstrom A, Korpela, S., Fries, I. (2008b) Horizontal transmission of Paenibacillus larvae spores between honey bee (Apis mellifera) colonies through robbing. Apidologie 39: 1-8
Liu YH, Ream A (2008) Gene Expression Profiling of Listeria monocytogenes Strain F2365 during Growth in Ultrahigh-Temperature-Processed Skim Milk. Applied and Environmental Microbiology 74(22): 6859-6866
Luong TT, Sau K, Roux C, Sau S, Dunman PM, Lee CY (2011) Staphylococcus aureus ClpC Divergently Regulates Capsule via sae and codY in Strain Newman but Activates Capsule via codY in Strain UAMS-1 and in Strain Newman with Repaired saeS. Journal of Bacteriology 193(3): 686-694
Maroufi A, Van Bockstaele E, De Loose M (2010) Validation of reference genes for gene expression analysis in chicory (Cichorium intybus) using quantitative real-time PCR. Bmc Molecular Biology 11
Mattinen L, Somervuo P, Nykyri J, Nissinen R, Kouvonen P, Corthals G, Auvinen P, Aittamaa M, Valkonen JPT, Pirhonen M (2008) Microarray profiling of host-extract-induced genes and characterization of the type VI secretion cluster in the potato pathogen Pectobacterium atrosepticum. Microbiology-Sgm 154: 2387-2396
McCleskey CS, Melampy RM (1939) Bactericidal properties of royal jelly of the honeybee. Journal of economic entomology 32: 581-587
Mohr KI, Tebbe CC (2006) Diversity and phylotype consistency of bacteria in the guts of three bee species (Apoidea) at an oilseed rape field. Environmental Microbiology 8(2): 258-272
Morse RA, Calderon (2000) The value of honey bee pollination in the United States. Bee Cult 128: 1-15
Nair S, Milohanic E, Berche P (2000) ClpC ATPase is required for cell adhesion and invasion of Listeria monocytogenes. Infection and Immunity 68(12): 7061-7068
Neuendorf S, Hedtke K, Tangen G, Genersch E (2004) Biochemical characterization of different genotypes of Paenibacillus larvae subsp. larvae, a honey bee bacterial pathogen. Microbiology 150(Pt 7): 2381-2390
Nordstrom S, Fries I (1995) A comparison of media and cultural conditions for identification of Bacillus larvae in honey. Journal of Apicultural Research 34(2): 97-103
Olsen PE, Grant GA, Nelson DL, Rice WA (1990) Detection of American Foulbrood Disease of the Honeybee, Using a Monoclonal-Antibody Specific to Bacillus-Larvae in an Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay. Canadian Journal of Microbiology 36(10): 732-735
Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP (2004) Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper - Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnology Letters 26(6): 509-515
Predich M, Nair G, Smith I (1992) Bacillus-Subtilis Early Sporulation Genes Kina, Spo0f, and Spo0a Are Transcribed by the Rna-Polymerase Containing Sigma-H. Journal of Bacteriology 174(9): 2771-2778
Qin X, Evans JD, Aronstein KA, Murray KD, Weinstock GM (2006) Genome sequences of the honey bee pathogens Paenibacillus larvae and Ascosphaera apis. Insect Mol Biol 15(5): 715-718
Randolt K, Gimple O, Geissendorfer J, Reinders J, Prusko C, Mueller MJ, Albert S, Tautz J, Beier H (2008) Immune-Related Proteins Induced in the Hemolymph After Aseptic and Septic Injury Differ in Honey Bee Worker Larvae and Adults. Archives of Insect Biochemistry and Physiology 69(4): 155-167
Rauch S, Ashiralieva A, Hedtke K, Genersch E (2009) Negative correlation between individual-insect-level virulence and colony-level virulence of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American foulbrood of honeybees. Appl Environ Microbiol 75(10): 3344-3347
Reva O, Tummler B (2008) Think big--giant genes in bacteria. Environ Microbiol 10(3): 768-777
Robertson GT, Ng WL, Foley J, Gilmour R, Winkler ME (2002) Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and virulence. Journal of Bacteriology 184(13): 3508-3520
Scharlaken B, de Graaf DC, Goossens K, Peelman LJ, Jacobs FJ (2008) Differential gene expression in the honeybee head after a bacteria challenge. Developmental and Comparative Immunology 32(8): 883-889
Schmidt H, Hensel M (2004) Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews 17(1): 14
Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Feitelson J, Zeigler DR, Dean DH (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3): 775
Schotanus A (2009) Bloedernstig. Maandblad van de Vlaamse imkersbond 3: 14-16
Shapiro-Ilan DI, Fuxa JR, Lacey LA, Onstad DW, Kaya HK (2005) Definitions of pathogenicity and virulence in invertebrate pathology. Journal of Invertebrate Pathology 88(1): 1-7
Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, De Borman B, Coumans B, Hennen G, Grisar T, Igout A, Heinen E (1999) Housekeeping genes as internal standards: use and limits. Journal of Biotechnology 75(2-3): 291-295
Tzou P, De Gregorio E, Lemaitre B (2002) How Drosophila combats microbial infection: a model to study innate immunity and host-pathogen interactions. Current Opinion in Microbiology 5(1): 102-110
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002) Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 3(7): RESEARCH0034
vanEngelsdorp D, Meixner MD (2010) A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology 103: S80-S95
Waddell SJ, Butcher PD, Stoker NG (2007) RNA profiling in host-pathogen interactions. Current Opinion in Microbiology 10(3): 297-302
Woodrow (1942) Susceptibility of honeybee larvae to individual inoculations with spores of Bacillus larvae. Journal of economic entomology 35: 892-895
Wyatt GR (1961) Biochemistry of Insect Hemolymph. Annual Review of Entomology 6: 75
Yamamoto T, Sashinami H, Takaya A, Tomoyasu T, Matsui H, Kikuchi Y, Hanawa T, Kamiya S, Nakane A (2001) Disruption of the genes for ClpXP protease in Salmonella enterica serovar typhimurium results in persistent infection in mice, and development of persistence requires endogenous gamma interferon and tumor necrosis factor alpha. Infection and Immunity 69(5): 3164-3174
Yue D, Nordhoff M, Wieler LH, Genersch E (2008) Fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of the interactions between honeybee larvae and Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood of honeybees (Apis mellifera). Environ Microbiol 10(6): 1612-1620