The viability of the lipoaspirate after sieving into different particle size fractions, an experimental study

Maxim Geeroms
Plastisch chirurgen willen de herhaalde operaties na een borstreconstructie overbodig makenIn de Vrije Universiteit Brussel (VUB) en het verbonden Universitaire Ziekenhuis Brussel wordt onderzoek gevoerd om meer succes te boeken met lipofilling. Dit is een techniek waarbij vetweefsel door liposuctie wordt weggezogen en vervolgens opnieuw ingebracht. Uiteraard bij dezelfde patiënte, maar wel op een andere plaats, zoals bv. in een gereconstrueerde borst.

The viability of the lipoaspirate after sieving into different particle size fractions, an experimental study

Plastisch chirurgen willen de herhaalde operaties na een borstreconstructie overbodig maken

In de Vrije Universiteit Brussel (VUB) en het verbonden Universitaire Ziekenhuis Brussel wordt onderzoek gevoerd om meer succes te boeken met lipofilling. Dit is een techniek waarbij vetweefsel door liposuctie wordt weggezogen en vervolgens opnieuw ingebracht. Uiteraard bij dezelfde patiënte, maar wel op een andere plaats, zoals bv. in een gereconstrueerde borst. Het resultaat van de operatie wordt bepaald door talrijke factoren en dit heeft ertoe geleid dat lipofilling vandaag een hot topic is in de research wereld. Ook in het UZ Brussel dragen de plastisch chirurgen hun steentje bij. Zij hebben een rapport uitgebracht van de eerste resultaten die ze geboekt hebben.

Vrouwen die een borstamputatie hebben ondergaan in de behandeling van borstkanker, hebben niet steeds dezelfde wens. Sommige patiëntes willen het volledig proces zo snel mogelijk beëindigen en blijven liever weg uit ziekenhuizen. Eventueel kunnen zij een uitwendige prothese dragen. Andere vrouwen opteren voor een operatie die hen een nieuwe borst schenkt. Dit kan met een inwendige prothese of met een zogenaamde flap die bestaat uit lichaamseigen weefsel. Dankzij de ontwikkelingen tijdens de laatste decennia in de plastische chirurgie, kiezen vrouwen steeds vaker voor deze laatste optie. Uiteraard wordt nooit een perfecte kopie gecreëerd en blijven correcties wenselijk.

Lipofilling

En die correcties kunnen bekomen worden met lipofilling. Terwijl het opgezogen vetweefsel bij liposuctie meestal wordt vernietigd, kan het bij deze patiëntes gebruikt worden als filler. Stap per stap kan het vetweefsel geïnjecteerd worden om de borst meer volume en een natuurlijke ronding te geven. Het weefsel is zacht en warm en het uiteindelijke doel is om weer symmetrie te krijgen tussen de linker- en rechterkant. Bovendien gaat het om het inspuiten van lichaamseigen weefsel wat het risico op allergische reacties of verwikkelingen na de operatie zeer klein maakt. Dit klinkt veelbelovend en toch is er een nadeel. Het resultaat gaat niet levenslang mee. Zelfs al na enkele weken, is er vermindering in volume zichtbaar. Soms blijft na een jaar slechts de helft van het ingespoten materiaal over en dringt een tweede, en eventueel een derde, lipofillingsessie zich op.

Hot topic

Dit heeft geleid tot een massa aan onderzoeksprojecten over de hele wereld. Vinden we beter vetweefsel in de buik of in de billen? Hoe lang steken we dit geaspireerde vetweefsel in de centrifuge om het vetweefsel te concentreren? Hoe snel laten we de centrifuge draaien? Op welke manier injecteren we het vet opnieuw in de patiënte? Elke stap in het proces van liposuctie tot lipofilling is ondertussen bestudeerd. De basis van het onderzoek is de cell survival theory, die ondertussen meer dan een halve eeuw oud is. Volgens deze theorie zal het resultaat langer behouden blijven als levende vetcellen geïnjecteerd worden. Door de liposuctie, de centrifugatie en het injecteren wordt het vetweefsel immers onderworpen aan mechanische krachten en een periode van zuurstoftekort, waardoor vetcellen kunnen afsterven.

Zeefjes

Vetcellen zijn niet de enige cellen in het vetweefsel. Ook stamcellen en onrijpe vetcellen worden gevonden en zij spelen zeker hun rol. Dit vormde de basis van het onderzoek op de dienst plastische en reconstructieve heelkunde van het UZ Brussel dat gevoerd werd door dr. Maxim Geeroms en dr. Barbara Craggs onder leiding van professor Moustapha Hamdi. Om het slinkende ingespoten vet en de extra lipofillingsessies te vermijden, onderzochten zij of met een extra stap tijdens de operaties het geschikte vetweefsel zou kunnen geselecteerd worden. Door het opgezogen vetweefsel te scheiden met zeefjes, verkregen zij 4 verschillende groepen met groepjes vetcellen en andere cellen van verschillende grootte. Nadien werd het percentage levende cellen geteld in elke groep. Ook de samenstelling van elke groep werd microscopisch bestudeerd.

Verder onderzoek

Ondertussen werd in het laboratorium van de VUB vetweefsel bestudeerd van 7 patiëntes die liposuctie ondergingen. Uit deze eerste testen blijkt dat, na het zeven van het vet, er een licht voordeel is voor de stalen met de kleinste groepjes van samengeklitte cellen wat betreft het aantal levende cellen. Ook de samenstelling van het vetweefsel is niet helemaal dezelfde in de grote en de kleine groepen. Dr. Geeroms benadrukt echter dat er voorlopig geen grote verschillen werden gevonden: "Door dit beperkte aantal van 7 patiëntes kunnen wij op dit moment nog geen interessante conclusies trekken. We merken wel een trend, zowel in de leefbaarheid van de cellen als in de compositie van het staal, maar verder onderzoek blijft noodzakelijk. Hiervan zal dan afhangen of wij het zeven en selecteren van vetweefsel tijdens de operatie kunnen aanraden voor een optimaal resultaat waardoor we bijkomende lipofillingsessies en de verbonden risico's en kosten kunnen vermijden."

Bibliografie
  1. Gutowski KA, ASPS Fat Graft Task Force. Current applications and safety of autologous fat grafts: a report of the ASPS Fat Graft Task Force. Plast Reconstr Surg. 2009 Jul;124(1):272-80. doi: 10.1097/PRS.0b013e3181a09506.
  2. Caviggioli F, Klinger F, Villani F, Fossati C, Vinci V, Klinger M. Correction of cicatricial ectropion by autologous fat graft. Aesthetic Plast Surg. 2008 May;32(3):555-7. doi: 10.1007/s00266-008-9117-y.
  3. Klinger M, Marazzi M, Vigo D, Torre M. Fat injection for cases of severe burn outcomes: a new perspective of scar remodeling and reduction. Aesthetic Plast Surg. 2008 May;32(3):465-9. doi: 10.1007/s00266-008-9122-1.
  4. Caviggioli F, Klinger FM, Vinci V, Cornegliani G, Klinger M. Treatment of chronic posttraumatic leg injury using autologous fat graft. Case Rep Med. 2012;2012:648683. doi: 10.1155/2012/648683. Epub 2012 Dec 19.
  5. Rigotti G, Marchi A, Galiè M, Baroni G, Benati D, Krampera M, Pasini A, Sbarbati A. Clinical treatment of radiotherapy tissue damage by lipoaspirate transplant: a healing process mediated by adipose-derived adult stem cells. Plast Reconstr Surg. 2007 Apr 15;119(5):1409-22; discussion 1423-4.
  6. Sarfati I, Ihrai T, Kaufman G, Nos C, Clough KB. Adipose-tissue grafting to the post-mastectomy irradiated chest wall: preparing the ground for implant reconstruction. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2011 Sep;64(9):1161-6. doi: 10.1016/j.bjps.2011.03.031. Epub 2011 Apr 22.
  7. Coleman SR. Hand rejuvenation with structural fat grafting. Plast Reconstr Surg. 2002 Dec;110(7):1731-44; discussion 1745-7.
  8. Fabi SG, Goldman MP. Hand rejuvenation: a review and our experience. Dermatol Surg. 2012 Jul;38(7 Pt 2):1112-27. doi: 10.1111/j.1524-4725.2011.02291.x. Epub 2012 Jan 23.
  9. Coleman SR. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plast Reconstr Surg. 2006 Sep;118(3 Suppl):108S-120S.
  10. Coleman SR. Facial augmentation with structural fat grafting. Clin Plast Surg. 2006 Oct;33(4):567-77.
  11. Xie Y, Zheng DN, Li QF, Gu B, Liu K, Shen GX, Pu LL. An integrated fat grafting technique for cosmetic facial contouring. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010 Feb;63(2):270-6. doi: 10.1016/j.bjps.2008.11.016. Epub 2008 Dec 13.
  12. Valdatta L, Cherubino M, Tamborini F, Pellegatta I, Maggiulli F. A case of facial lipoatrophy secondary to lupus profundus managed with lipofilling technique. Case Rep Dermatol Med. 2012;2012:720518. doi: 10.1155/2012/720518. Epub 2012 Dec 4.
  13. Meier JD, Glasgold RA, Glasgold MJ. Autologous fat grafting: long-term evidence of its efficacy in midfacial rejuvenation. Arch Facial Plast Surg. 2009 Jan-Feb;11(1):24-8. doi: 10.1001/archfacial.2008.518.
  14. Rietjens M, De Lorenzi F, Rossetto F, Brenelli F, Manconi A, Martella S, Intra M, Venturino M, Lohsiriwat V, Ahmed Y, Petit JY. Safety of fat grafting in secondary breast reconstruction after cancer. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2011 Apr;64(4):477-83. doi: 10.1016/j.bjps.2010.06.024. Epub 2010 Aug 7.
  15. Petit JY, Lohsiriwat V, Clough KB, Sarfati I, Ihrai T, Rietjens M, Veronesi P, Rossetto F, Scevola A, Delay E. The oncologic outcome and immediate surgical complications of lipofilling in breast cancer patients: a multicenter study Milan – Paris - Lyon experience of 646 lipofilling procedures. Plast Reconstr Surg. 2011 Aug;128(2):341-6. doi: 10.1097/PRS.0b013e31821e713c.
  16. Le Brun JF, Dejode M, Campion L, Jaffré I, Bordes V, Classe JM, Oger AS, Dravet F. Qualité de vie après lipomodelage : etude rétrospective à propos de 42 patientes. Ann Chir Plast Esthet. 2013 Mar 18. doi:pii: S0294-1260(13)00006-X. 10.1016/j.anplas.2013.01.005.
  17. Schultz I, Lindegren A, Wickman M. Improved shape and consistency after lipofilling of the breast: patients' evaluation of the outcome. J Plast Surg Hand Surg. 2012 Apr;46(2):85-90. doi: 10.3109/2000656X.2011.653256.
  18. Bruning P. Contribution à l’étude des greffes adipeuses. Bull Acad R Med Belg. 1919;28:440-444.
  19. Illouz YG. The fat cell "graft": a new technique to fill depressions. Plast Reconstr Surg. 1986 Jul;78(1):122-3.
  20. Illouz YG. Present results of fat injection. Aesthetic Plast Surg. 1988 Aug;12(3):175-81.
  21. Teimourian B, Fisher JB. Suction curettage to remove excess fat for body contouring. Plast Reconstr Surg. 1981 Jul;68(1):50-8.
  22. Illouz YG. Body contouring by lipolysis: a 5-year experience with over 3000 cases. Plast Reconstr Surg. 1983 Nov;72(5):591-7.
  23. Illouz YG. Surgical remodeling of the silhouette by aspiration lipolysis or selective lipectomy. Aesthetic Plast Surg. 1985;9(1):7-21.
  24. Hsieh CC, Trichopoulos D, Katsouyanni K, Yuasa S. Age at menarche, age at menopause, height and obesity as risk factors for breast cancer: associations and interactions in an international case-control study. Int J Cancer. 1990 Nov 15;46(5):796-800.
  25. Schäffler A, Schölmerich J, Buechler C. Mechanisms of disease: adipokines and breast cancer - endocrine and paracrine mechanisms that connect adiposity and breast cancer. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2007 Apr;3(4):345-54.
  26. Petit JY, Botteri E, Lohsiriwat V, Rietjens M, De Lorenzi F, Garusi C, Rossetto F, Martella S, Manconi A, Bertolini F, Curigliano G, Veronesi P, Santillo B, Rotmensz N. Locoregional recurrence risk after lipofilling in breast cancer patients. Ann Oncol. 2012 Mar;23(3):582-8. doi: 10.1093/annonc/mdr158. Epub 2011 May 24.
  27. Choi M, Small K, Levovitz C, Lee C, Fadl A, Karp N. The volumetric analysis of fat graft survival in breast reconstruction. Plast Reconstr Surg. 2013 Feb;131(2):185-91. doi: 10.1097/PRS.0b013e3182789b13.
  28. Cigna E, Ribuffo D, Sorvillo V, Atzeni M, Piperno A, Calò PG, Scuderi N. Secondary lipofilling after breast reconstruction with implants. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012 Nov;16(12):1729-34.
  29. Peer LA. Loss of weight and volume in human fat grafts. Plast Reconstr Surg 1950;5:217-30.
  30. Billings E Jr, May JW Jr. Historical review and present status of free fat graft autotransplantation in plastic and reconstructive surgery. Plast Reconstr Surg. 1989 Feb;83(2):368-81.
  31. Ullmann Y, Shoshani O, Fodor A, Ramon Y, Carmi N, Eldor L, Gilhar A. Searching for the favorable donor site for fat injection: in vivo study using the nude mice model. Dermatol Surg. 2005 Oct;31(10):1304-7.
  32. Li K, Gao J, Zhang Z, Li J, Cha P, Liao Y, Wang G, Lu F. Selection of donor site for fat grafting and cell isolation. Aesthetic Plast Surg. 2013 Feb;37(1):153-8. doi: 10.1007/s00266-012-9991-1. Epub 2012 Dec 12.
  33. Rohrich RJ, Sorokin ES, Brown SA. In search of improved fat transfer viability: a quantitative analysis of the role of centrifugation and harvest site. Plast Reconstr Surg. 2004 Jan;113(1):391-5; discussion 396-7.
  34. Erdim M, Tezel E, Numanoglu A, Sav A. The effects of the size of liposuction cannula on adipocyte survival and the optimum temperature for fat graft storage: an experimental study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2009 Sep;62(9):1210-4. doi: 10.1016/j.bjps.2008.03.016. Epub 2008 Jun 20.
  35. Kirkham JC, Lee JH, Medina MA, McCormack MC, Randolph MA, Austen WG Jr. The impact of liposuction cannula size on adipocyte viability. Ann Plast Surg. 2012 Oct;69(4):479-81. doi: 10.1097/SAP.0b013e31824a459f.
  36. Pu LL. Towards more rationalized approach to autologous fat grafting. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2012 Apr;65(4):413-9. doi: 10.1016/j.bjps.2011.09.033. Epub 2011 Oct 22.
  37. Shiffman MA, Mirrafati S. Fat transfer techniques: the effect of harvest and transfer methods on adipocyte viability and review of the literature. Dermatol Surg. 2001 Sep;27(9):819-26.
  38. Crawford JL, Hubbard BA, Colbert SH, Puckett CL. Fine tuning lipoaspirate viability for fat grafting. Plast Reconstr Surg. 2010 Oct;126(4):1342-8. doi: 10.1097/PRS.0b013e3181ea44a9.
  39. Ramon Y, Shoshani O, Peled IJ, Gilhar A, Carmi N, Fodor L, Risin Y, Ullmann Y. Enhancing the take of injected adipose tissue by a simple method for concentrating fat cells. Plast Reconstr Surg. 2005 Jan;115(1):197-201; discussion 202-3.
  40. Xie Y, Zheng D, Li Q, Chen Y, Lei H, Pu LL. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010 Mar;63(3):482-7. doi: 10.1016/j.bjps.2008.11.056. Epub 2009 Jan 6.
  41. Condé-Green A, Baptista LS, de Amorin NF, de Oliveira ED, da Silva KR, Pedrosa Cda S, Borojevic R, Pitanguy I. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthet Surg J. 2010 Mar;30(2):249-55. doi: 10.1177/1090820X10369512.
  42. Condé-Green A, de Amorim NF, Pitanguy I. Influence of decantation, washing and centrifugation on adipocyte and mesenchymal stem cell content of aspirated adipose tissue: a comparative study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010 Aug;63(8):1375-81. doi: 10.1016/j.bjps.2009.07.018. Epub 2009 Aug 12.
  43. Moscatello DK, Dougherty M, Narins RS, Lawrence N. Cryopreservation of human fat for soft tissue augmentation: viability requires use of cryoprotectant and controlled freezing and storage. Dermatol Surg. 2005 Nov;31(11 Pt 2):1506-10.
  44. Lee JH, Kirkham JC, McCormack MC, Medina MA, Nicholls AM, Randolph MA, Austen WG Jr. A novel approach to adipocyte analysis. Plast Reconstr Surg. 2012 Feb;129(2):380-7. doi: 10.1097/PRS.0b013e31823aea29.
  45. Suga H, Matsumoto D, Inoue K, Shigeura T, Eto H, Aoi N, Kato H, Abe H, Yoshimura K. Numerical measurement of viable and nonviable adipocytes and other cellular components in aspirated fat tissue. Plast Reconstr Surg. 2008 Jul;122(1):103-14. doi: 10.1097/PRS.0b013e31817742ed.
  46. Medina MA, Nguyen JT, McCormack MM, Randolph MA, Austen WG Jr. A high-throughput model for fat graft assessment. Lasers Surg Med. 2009 Dec;41(10):738-44. doi: 10.1002/lsm.20874.
  47. Boschert MT, Beckert BW, Puckett CL, Concannon MJ. Analysis of lipocyte viability after liposuction. Plast Reconstr Surg. 2002 Feb;109(2):761-5; discussion 766-7.
  48. Miyazaki T, Kitagawa Y, Toriyama K, Kobori M, Torii S. Isolation of two human fibroblastic cell populations with multiple but distinct potential of mesenchymal differentiation by ceiling culture of mature fat cells from subcutaneous adipose tissue. Differentiation. 2005 Mar;73(2-3):69-78.
  49. Pu LL, Cui X, Fink BF, Gao D, Vasconez HC. Adipose aspirates as a source for human processed lipoaspirate cells after optimal cryopreservation. Plast Reconstr Surg. 2006 May;117(6):1845-50.
  50. Pu LL, Coleman SR, Cui X, Ferguson RE Jr, Vasconez HC. Cryopreservation of autologous fat grafts harvested with the Coleman technique. Ann Plast Surg. 2010 Mar;64(3):333-7. doi: 10.1097/SAP.0b013e3181b022cb.
  51. Pu LL, Cui X, Fink BF, Cibull ML, Gao D. The viability of fatty tissues within adipose aspirates after conventional liposuction: a comprehensive study. Ann Plast Surg. 2005 Mar;54(3):288-92; discussion 292.
  52. Li BW, Liao WC, Wu SH, Ma H. Cryopreservation of fat tissue and application in autologous fat graft: in vitro and in vivo study. Aesthetic Plast Surg. 2012 Jun;36(3):714-22. doi: 10.1007/s00266-011-9848-z. Epub 2011 Dec 22.
  53. Son D, Oh J, Choi T, Kim J, Han K, Ha S, Lee K. Viability of fat cells over time after syringe suction lipectomy: the effects of cryopreservation. Ann Plast Surg. 2010 Sep;65(3):354-60. doi: 10.1097/SAP.0b013e3181bb49b8.
  54. Pu LL, Cui X, Fink BF, Cibull ML, Gao D. Long-term preservation of adipose aspirates after conventional lipoplasty. Aesthet Surg J. 2004 Nov-Dec;24(6):536-41. doi: 10.1016/j.asj.2004.09.002.
  55. Zeltzer AA, Tonnard PL, Verpaele AM. Sharp-needle intradermal fat grafting (SNIF). Aesthet Surg J. 2012 Jul;32(5):554-61. doi: 10.1177/1090820X12445082.
  56. Yoshimura K, Shigeura T, Matsumoto D, Sato T, Takaki Y, Aiba-Kojima E, Sato K, Inoue K, Nagase T, Koshima I, Gonda K. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 2006 Jul;208(1):64-76.
  57. von Heimburg D, Hemmrich K, Haydarlioglu S, Staiger H, Pallua N. Comparison of viable cell yield from excised versus aspirated adipose tissue. Cells Tissues Organs. 2004;178(2):87-92.
  58. van Harmelen V, Skurk T, Hauner H. Primary culture and differentiation of human adipocyte precursor cells. Methods Mol Med. 2005;107:125-35.
  59. Strem BM, Hicok KC, Zhu M, Wulur I, Alfonso Z, Schreiber RE, Fraser JK, Hedrick MH. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 2005 Sep;54(3):132-41.
  60. van Harmelen V, Skurk T, Röhrig K, Lee YM, Halbleib M, Aprath-Husmann I, Hauner H. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. Int J Obes Relat Metab Disord. 2003 Aug;27(8):889-95.
  61. Tyler MS. Chapter 12: Histological techniques. In: Developmental Biology, A Guide for Experimental Study. 3rd edition. Sinauer Associates, Sunderland, Massachussetts. 2003:204-19.
  62. Aksoy M. Benzene as a leukemogenic and carcinogenic agent. Am J Ind Med. 1985;8(1):9-20.
  63. http://dako.com/be/ar38/p119250/prod_products.htm. 2010. Polyclonal Rabbit Anti-S100. Dako, Glostrup, Denmark.
  64. Gonçalves CA, Leite MC, Guerra MC. Adipocytes as an important source of serum S100B and possible roles of this protein in adipose tissue. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2010;2010:790431. doi: 10.1155/2010/790431. Epub 2010 Jun 28.
  65. Donato R. Perspectives in S-100 protein biology. Review article. Cell Calcium. 1991 Nov;12(10):713-26.
  66. Zimmer DB, Cornwall EH, Landar A, Song W. The S100 protein family: history, function, and expression. Brain Res Bull. 1995;37(4):417-29.
  67. Orchard GE. Comparison of immunohistochemical labelling of melanocyte differentiation antibodies melan-A, tyrosinase and HMB 45 with NKIC3 and S100 protein in the evaluation of benign naevi and malignant melanoma. Histochem J. 2000 Aug;32(8):475-81.
  68. Ye F, Huang S-W, Dong H-J. Histiocytosis X. S-100 protein, peanut agglutinin, and transmission electron microscopy study. Am J Clin Pathol 1990;94:627-31.
  69. Edel G, Ueda Y, Nakanishi J, Brinker KH, Roessner A, Blasius S, et al. Chondroblastoma in bone. A clinical, radiological, light and immunohistochemical study. Virchows Arch A Pathol Anat 1992;421:355-66.
  70. Gould VE, Moll R, Moll I, Lee I, Schwechheimer K, Franke WW. The intermediate filament complement of the spectrum of nerve sheath neoplasms. Lab Invest 1986;55:463-74.
  71. Kindblom LG, Meis-Kindblom JM. Chondroid lipoma: an ultrastructural and immunohistochemical analysis with further observations regarding its differentiation. Hum Pathol. 1995 Jul;26(7):706-15.
  72. Cinti S, Cigolini M, Morroni M, Zingaretti MC. S-100 protein in white preadipocytes: an immunoelectronmicroscopic study. Anat Rec. 1989 Aug;224(4):466-72.
  73. Kato K, Suzuki F, Ogasawara N. Induction of S100 protein in 3T3-L1 cells during differentiation to adipocytes and its liberating by lipolytic hormones. Eur J Biochem. 1988 Nov 1;177(2):461-6.
  74. Daya S, Loughlin AJ, Macqueen HA. Culture and differentiation of preadipocytes in two-dimensional and three-dimensional in vitro systems. Differentiation. 2007 Jun;75(5):360-70. Epub 2007 Feb 5.
  75. Zar JH. Biostatistical analysis. 2nd edition. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey. 1984.
  76. Machin D, Campbell MJ, Fayers PM, Pinol APY. Sample Size Tables for Clinical Studies. 2nd edition. Blackwell Science, Oxford, London. 1997.