High-throughput screening of antimicrobial peptides against Candida krusei and Cryptococcus neoformans

Valerie Van Laere
De antibiotica-crisis voorbij: antimicrobiële peptiden als potentiële alternatieven Het optreden van resistentie tegen het huidige antibioticagamma bij verscheidene micro-organismen resulteert in een expanderende gezondheidsgerelateerde bedreiging op wereldwijd niveau. In de zoektocht naar vervangers voor de falende klassieke antibioticatherapie worden antimicrobiële peptiden beschouwd als één van de veelbelovende alternatieven.

High-throughput screening of antimicrobial peptides against Candida krusei and Cryptococcus neoformans

De antibiotica-crisis voorbij:

antimicrobiële peptiden als potentiële alternatieven

 

Het optreden van resistentie tegen het huidige antibioticagamma bij verscheidene micro-organismen resulteert in een expanderende gezondheidsgerelateerde bedreiging op wereldwijd niveau. In de zoektocht naar vervangers voor de falende klassieke antibioticatherapie worden antimicrobiële peptiden beschouwd als één van de veelbelovende alternatieven. Voor het onderzoek “High-throughput screening of  antimicrobial peptides against Candida krusei and Cryptococcus neoformans” werden twee peptide databanken getest op hun antimicrobiële activiteit tegen de fungi Candida krusei en Cryptococcus neoformans. Hieruit werden enkele veelbelovende kandidaten gedetecteerd die in verder onderzoek en na eventuele optimalisatiestappen als mogelijke substitutietherapie van de actuele antifungische agentia kunnen aangewend worden.

Antimicrobiële peptiden als alternatieven voor de huidige resistentieonderhevige antibiotica

Antimicrobiële peptiden zijn beloftevolle alternatieven in de zoektocht naar nieuwe potentiële geneesmiddelen tegen micro-organismen, die ten gevolge van het huidige, toenemend probleem van (multi)drugresistentie een risico voor de humane gezondheid vormen op een universeel niveau. Deze in verscheidene species natuurlijke voorkomende peptiden vertonen een breed spectrum activiteit, een snelle werking en een lage vatbaarheid voor resistentie. Ze worden mede daardoor onderzocht tegen verscheidene micro-organismen, waaronder fungi. Fungi zijn één van de primaire oorzaken van letale infecties in immunogecompromitteerde patiënten. De huidige bestaande antifungische geneesmiddelen zijn gelimiteerd, niet zo efficiënt als gewenst en zijn ook onderworpen aan resistentie problemen.

Antimicrobiële activiteit van de peptide databanken testen via een op fluorescentie gebaseerde screening methode

Het hoofdobjectief van het onderzoek was het identificeren van veelbelovende antimicrobiële peptiden actief tegen de fungi Candida krusei en Cryptococcus neoformans via een op fluorescentie gebaseerde high-troughput screening van twee peptidenbibliotheken. Deze screening methode is gebaseerd op de blauwe kleurstof resazurine, die een lage intrinsieke fluorescentie heeft en door viabele fungale cellen tot de roze fluorescerende resorufin gereduceerd wordt. De gemeten fluorescentie correleert met de hoeveelheid viabele cellen en daardoor met de activiteit van de peptiden. Het antifungisch potentieel van 240 synthetische nonapeptiden en van 430 in de natuur voorkomende peptiden werd onderzocht.

De beloftevolle kandidaten

Zeven sterk actieve peptiden werden gevonden tegen Cryptococcus neoformans, waarvan twee van de synthetische peptidenbibliotheek en vijf van de natuurlijke peptidenbibliotheek afkomstig zijn. Negen peptiden van de natuurlijke peptide bibliotheek werden zeer actief bevonden tegen Candida krusei, terwijl geen synthetische peptiden sterke activiteit tegen dit micro-organisme vertoonden. Zowel selectieve peptiden tegen Candida krusei alleen (één synthetische peptide en drie natuurlijke peptiden) of tegen Cryptococcus neoformans alleen (één synthetische peptide en één natuurlijke peptide) als breed spectrum peptiden (twee synthetische peptiden en vijf natuurlijke peptiden) werden gedetecteerd.

Correlatie tussen antimicrobiële activiteit en karakteristieken van de peptiden

Daarbovenop was het doel om informatie over belangrijke karakteristieken van de peptiden te bekomen die helpen om  de peptiden te onderscheiden op basis van hun activiteit. Een analyse van de distributie en de posities van de aminozuren in de peptidensequenties en een eendimensionale ANOVA analyse betreffende deze peptide eigenschappen worden hiervoor uitgevoerd. Algemeen kon besloten worden dat de juiste balans tussen hydrofobe en positief geladen aminozuren vereist is om sterk actieve peptiden te verkrijgen tegen de geteste fungi.

Toekomstig werk

De interessant bevonden peptiden kunnen geoptimaliseerd worden op basis van voorgaande analyse resultaten en andere technieken. Ze kunnen dan opnieuw gescreend worden tot het gewenste therapeutische potentieel bereikt is. 

Bibliografie

1. World Health Organization, & Who. (2001). WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance. World Health, WHO/CDS/CS, 105. Retrieved from http://scholar.google.com/scholar?hl=en&btnG=Search&q=intitle:WHO+Globa…. O’Neill, J. (2014). Antimicrobial Resistance : Tackling a crisis for the health and wealth of nations. Review on Antimicrobial Resistance, (December).3. Perea, S., & Patterson, T. F. (2002). Antifungal resistance in pathogenic fungi. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 35(9), 1073–1080. http://doi.org/10.1086/3440584. Hilpert, K., Volkmer-Engert, R., Walter, T., & Hancock, R. E. W. (2005). High-throughput generation of small antibacterial peptides with improved activity. Nature Biotechnology, 23(8), 1008–1012. http://doi.org/10.1038/nbt11135. Pinheiro Da Silva, F., & MacHado, M. C. C. (2012). Antimicrobial peptides: Clinical relevance and therapeutic implications. Peptides. http://doi.org/10.1016/j.peptides.2012.05.014 6. Ashby, M., Petkova, A., & Hilpert, K. (2014). Cationic antimicrobial peptides as potential new therapeutic agents in neonates and children: a review. Current Opinion in Infectious Diseases, 27(3), 258–67. http://doi.org/10.1097/QCO.00000000000000577. Nakatsuji, T., & Gallo, R. L. (2012). Antimicrobial Peptides: Old Molecules with New Ideas. Journal of Investigative Dermatology. http://doi.org/10.1038/jid.2011.3878. Phoenix, D. A., Dennison, S. R., & Harris, F. (2013). Antimicrobial Peptides : Their History , Evolution , and Functional Promiscuity. In Antimicrobial peptides (pp. 1–37). http://doi.org/10.1002/9783527652853.ch19. Brogden, K. A. (2005). Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nature Reviews. Microbiology, 3(3), 238–250. http://doi.org/10.1038/nrmicro1098 10. Wang, G., Li, X., & Wang, Z. (2009). ADPD2 - Antimicrobial peptide database. http://doi.org/10.1093/nar/gkn82311. De Lucca, A. J., & Walsh, T. J. (1999). Antifungal peptides: Novel therapeutic compounds against emerging pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 43(1), 1–11.12. Mania, D., Hilpert, K., Ruden, S., Fischer, R., & Takeshita, N. (2010). Screening for antifungal peptides and their modes of action in Aspergillus nidulans. Applied and Environmental Microbiology, 76(21), 7102–7108. http://doi.org/10.1128/AEM.01560-1013. Loeffler, J., & Stevens, D. A. (2003). Antifungal drug resistance. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 36(Suppl 1), S31–S41. http://doi.org/10.1086/344658 14.  Low, C.-Y., & Rotstein, C. (2011). Emerging fungal infections in immunocompromised patients. F1000 Medicine Reports, 3, 14. http://doi.org/10.3410/M3-14 15. Haney, E. F., & Hancock, R. E. W. (2013). Peptide design for antimicrobial and immunomodulatory applications. Biopolymers. http://doi.org/10.1002/bip.22250 16. Guilhelmelli, F., Vilela, N., Albuquerque, P., Derengowski, L. da S., Silva-Pereira, I., & Kyaw, C. M. (2013). Antibiotic development challenges: The various mechanisms of action of antimicrobial peptides and of bacterial resistance. Frontiers in Microbiology. http://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00353x17. Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. (2013). Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cellular and Molecular Life Sciences.http://doi.org/10.1007/s00018-013-1260118. Samaranayake, Y. H., & Samaranayake, L. P. (1994). Candida krusei: Biology, epidemiology, pathogenicity and clinical manifestations of an emerging pathogen. Journal of Medical Microbiology. http://doi.org/10.1099/00222615-41-5-29519. Pfaller, M. a., Diekema, D. J., Gibbs, D. L., Newell, V. a., Nagy, E., Dobiasova, S., … Santiago, A. (2008). Candida krusei, a multidrug-resistant opportunistic fungal pathogen: Geographic and temporal trends from the ARTEMIS DISK Antifungal Surveillance Program, 2001 to 2005. Journal of Clinical Microbiology, 46(2), 515–521. http://doi.org/10.1128/JCM.01915-0720. Gubbins, P. O., Anaissie, E. J., McGinnis, M. R., & Pfaller, M. A. (2009). Candida. In Clinical Mycology 2nd ed (pp. 195–239). 21. Gubbins, P. O., Anaissie, E. J., McGinnis, M. R., & Pfaller, M. A. (2009). Cryptococcus. In Clinical Mycology 2nd ed (pp. 240–259). 22.  Bose, I., Reese, A. J., Ory, J. J., Doering, T. L., & Janbon, G. (2003). A Yeast under Cover : the Capsule of Cryptococcus neoformans, 2(4), 655–663. http://doi.org/10.1128/EC.2.4.65523. Archibald, L. K., Tuohy, M. J., Wilson, D. A., Nwanyanwu, O., Kazembe, P. N., Tansuphasawadikul, S., … Procop, G. W. (2004). Antifungal Susceptibilities of Cryptococcus neoformans. Emerging Infectious Diseases, 10(1), 143–145. http://doi.org/10.3201/eid1001.02077924. Loftus, B. J., Fung, E., Roncaglia, P., Rowley, D., Amedeo, P., Bruno, D., … Hyman, R. W. (2005). The genome of the basidiomycetous yeast and human pathogen Cryptococcus neoformans. Science (New York, N.Y.), 307(5713), 1321–1324. http://doi.org/10.1126/science.110377325. Sorrell, T. C., & Ellis, D. H. (1997). Ecology of Cryptococcus neoformans. Revista Iberoamericana de Micologia : Organo de La Asociacion Espanola de Especialistas En Micologia, 14(2), 42–43. http://doi.org/19971442 [pii] 26. Capenberghs, S. (2011). Vaste-fase Synthese van Sequentie Gecontroleerde Polymeren op Basis van Thiol “ Click ” Chemie.27. Hindriks, R. (1973). Vaste-fase peptidesynthesen: Synthese van oxytocine, vasopressine en menselijk calcitonine met behulp van een machine.28. Duro-Castano, A., Conejos-Sánchez, I., & Vicent, M. (2014). Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers, 6(2), 515–551. http://doi.org/10.3390/polym602051529. Carpino, L. A., & Han, G. Y. (1972). The 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J Org Chem, 37(22), 3404–3409. http://doi.org/10.1021/jo00795a00530. Winkler, D. F. H., & Campbell, W. D. (2008). The spot technique the spot technique: Synthesis and screening of peptide macroarrays on cellulose membranes. 31. Frank, R. (2002). The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports - Principles and applications. Journal of Immunological Methods, 267(1), 13–26. http://doi.org/10.1016/S0022-1759(02)00137-032. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., & Hancock, R. E. W. (2007). Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature Protocols, 2(6), 1333–1349. http://doi.org/10.1038/nprot.2007.16033. Arendrup,  M.,  Hope,  W.,  Lass-Flörl,  C.,  Cuenca-Estrella,  M.,  Arikan-Akdagli,  S.,  Barchiesi,  F.,  Verweij,  P.,  the  Subcommittee  on  Antifungal Susceptibility  Testing  (AFST)  of  the  ESCMID  European  Committee  for  Antimicrobial  Susceptibility  Testing  (EUCAST).  (2012).  Method  for  the determination of broth dilution minimum Inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts. Clinical Microbiology and Infection, 18(7), 1–21.. 34. Wiegand, I., Hilpert, K., & Hancock, R. E. W. (2008). Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols, 3(2), 163–175. http://doi.org/10.1038/nprot.2007.52135. O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., & Pognan, F. (2000). Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry, 267(17), 5421–5426. http://doi.org/10.1046/j.1432-1327.2000.01606.x36. Borra, R. C., Lotufo, M. A., Gagioti, S. M., Barros, F. D. M., & Andrade, P. M. (2009). A simple method to measure cell viability in proliferation and cytotoxicity assays. Brazilian Oral Research, 23(3), 255–262. http://doi.org/10.1590/S1806-8324200900030000637. Promega Corporation. (2013). CellTiter-Blue® Cell Viability Assay Protocol. Promega.com, 1–15. Retrieved from https://www.promega.com/~/media/Files/Resources/Protocols/Technical Bulletins/101/CellTiter-Blue Cell Viability Assay Protocol.pdf38. Fuller, B. J. (2004). Cryoprotectants: The essential antifreezes to protect life in the frozen state. Cryo-Letters. 39. Mikut, R. (2010). Computer-based analysis, visualization, and interpretation of antimicrobial peptide activities. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 618, 287–299. http://doi.org/10.1007/978-1-60761-594-1_18 40. Mikut, R., Reischl, M., Ulrich, A., & Hilpert, K. (2008). Data-Based Activity Analysis and Interpretation of Small Antibacterial Peptides. Proceedings of 18th Workshop on Computational Intellengence, 189–203. Retrieved from http://wwwserv1.iai.fzk.de/www-externkit/fileadmin/Image_Archive/Hochdu…. Data, P., & Data, P. (2008). EUCAST technical note on fluconazole. Clinical Microbiology and Infection : The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 14(2), 193–195. http://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2007.01899.x 42. International Union of Pure And Applied Chemistry, ., & International Union of Biochemistry, . (1971). International Union of Biochemistry a One-Letter Notation for Amino Acid Sequences ( Definitive Rules ) a One-Letter Notation for Amino Acid. IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, 639–645.43. Mikut, R., Ruden, S., Reischl, M., Breitling, F., Volkmer, R., Hilpert, K. (2015). Improving short antimicrobial peptides despite elusive rules of activity. Manuscript submitted for publication. 44. Kang, S. J., Won, H. S., Choi, W. S., & Lee, B. J. (2009). De novo generation of antimicrobial LK peptides with a single tryptophan at the critical amphipathic interface. In Journal of Peptide Science (Vol. 15, pp. 583–588). http://doi.org/10.1002/psc.114945. Wang, H., Yu, Z., Hu, Y., Li, F., Liu, L., Zheng, H., … Liu, J. (2012). Novel antimicrobial peptides isolated from the skin secretions of Hainan odorous frog, Odorrana hainanensis. Peptides, 35(2), 285–290. http://doi.org/10.1016/j.peptides.2012.03.00746. Muta, T., Fujimoto, T., Nakajima, H., & Iwanaga, S. (1990). Tachyplesins isolated from hemocytes of Southeast Asian horseshoe crabs (Carcinoscorpius rotundicauda and Tachypleus gigas): identification of a new tachyplesin, tachyplesin III, and a processing intermediate of its precursor. Journal of Biochemistry, 108(2), 261–266.47. Nakamura, T., Furunaka, H., Miyata, T., Tokunaga, F., Muta, T., Iwanaga, S., … Shimonishi, Y. (1988). Tachyplesin, a class of antimicrobial peptide from the hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus). Isolation and chemical structure. Journal of Biological Chemistry, 263(32), 16709–16713.48. Romeo, D., Skerlavaj, B., Bolognesi, M., & Gennaro, R. (1988). Structure and bactericidal activity of an antibiotic dodecapeptide purified from bovine neutrophils. Journal of Biological Chemistry, 263(20), 9573–9575. 49. Rozek, T., Wegener, K. L., Bowie, J. H., Olver, I. N., Carver, J. A., Wallace, J. C., & Tyler, M. J. (2000). The antibiotic and anticancer active aurein peptides from the Australian Bell Frogs Litoria aurea and Litoria raniformis: The solution structure of aurein 1.2. European Journal of Biochemistry, 267(17), 5330–5341. http://doi.org/10.1046/j.1432-1327.2000.01536.x 50. Yin, L. M., Edwards, M. A., Li, J., Yip, C. M., & Deber, C. M. (2012). Roles of hydrophobicity and charge distribution of cationic antimicrobial peptides in peptide-membrane interactions. Journal of Biological Chemistry, 287(10), 7738–7745. http://doi.org/10.1074/jbc.M111.30360251. Chan, D. I., Prenner, E. J., & Vogel, H. J. (2006). Tryptophan- and arginine-rich antimicrobial peptides: Structures and mechanisms of action. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. http://doi.org/10.1016/j.bbamem.2006.04.00652. Mahalakshmi, R., Franzin, C. M., Choi, J., & Marassi, F. M. (2007). NMR structural studies of the bacterial outer membrane protein OmpX in oriented lipid bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta, 1768(12), 3216–3224. http://doi.org/10.1016/j.bbamem.2007.08.00853. Lee, J., & Lee, D. G. (2010). Influence of the hydrophobic amino acids in the N- and C-terminal regions of pleurocidin on antifungal activity. Journal of Microbiology and Biotechnology, 20(8), 1192–1195. http://doi.org/10.4014/jmb.1004.0404154. Johnsen, L., Fimland, G., Eijsink, V., & Nissen-Meyer, J. (2000). Engineering increased stability in the antimicrobial peptide pediocin PA-1. Applied and Environmental Microbiology, 66(11), 4798–4802. http://doi.org/10.1128/AEM.66.11.4798-4802.200055. Pellegrini, A., Thomas, U., Bramaz, N., Klauser, S., Hunziker, P., & von Fellenberg, R. (1997). Identification and isolation  of a bactericidal domain in chicken egg white lysozyme. J Appl Microbiol, 82(3), 372–378. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1245590256. Broekaert, W. F., Mariën, W., Terras, F. R., De Bolle, M. F., Proost, P., Van Damme, J., … Vanderleyden, J. (1992). Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitin-binding proteins. Biochemistry, 31(17), 4308–4314. http://doi.org/doi: 10.1021/bi00132a02357. Sandberg, M., Eriksson, L., Jonsson, J., Sjöström, M., & Wold, S. (1998). New chemical descriptors relevant for the design of biologically active peptides. A multivariate characterization of 87 amino acids. Journal of Medicinal Chemistry, 41(14), 2481–2491. http://doi.org/10.1021/jm970057558. Guilhelmelli, F., Vilela, N., Albuquerque, P., Derengowski, L. da S., Silva-Pereira, I., & Kyaw, C. M. (2013). Antibiotic development challenges: The various mechanisms of action of antimicrobial peptides and of bacterial resistance. Frontiers in Microbiology. http://doi.org/10.3389/fmicb.2013.0035359. Larson, B., Held, P., & Banks, P. (n.d.). Improving Fluorescence-Based Assay Performance Using Automated Digital Microscopy Phenotypic Assay Analysis in Cells Live Cell Assay Analysis using a 3D Spheroid Model, 5404.60. PerkinElmer. (n.d.). Microplates for fluorescence assays. Retrieved May 7, 2015, from http://www.perkinelmer.com/resources/technicalresources/applicationsupp…. Cherkasov, A., Hilpert, K., Jenssen, H., Fjell, C. D., Waldbrook, M., Mullaly, S. C., … Hancock, R. E. W. (2009). Use of artificial intelligence in the design of small peptide antibiotics effective against a broad spectrum of highly antibiotic-resistant superbugs. ACS Chemical Biology, 4(1), 65–74. http://doi.org/10.1021/cb800240j62. Cuenca-Estrella, M., Gomez-Lopez, a., Cuesta, I., Zaragoza, O., Mellado, E., & Rodriguez-Tudela, J. L. (2011). Frequency of voriconazole resistance in vitro among Spanish clinical isolates of Candida spp. according to breakpoints established by the antifungal subcommittee of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 55(4), 1794–1797. http://doi.org/10.1128/AAC.01757-10 63. Winkler, D. F. H., & Hilpert, K. (2010). Synthesis of antimicrobial peptides using the SPOT technique.  Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 618, 111–124. http://doi.org/10.1007/978-1-60761-594-1_864. Souza, L. K. H., Fernandes, O. D. F. L., Kobayashi, C. C. B. A., Passos, X. S., Costa, C. R., Lemos, J. A., … Silva, M. D. R. R. (2005). Antifungal susceptibilities of clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans in Goiânia City, Goiás, Brazil. Revista Do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, 47(5), 253–256. http://doi.org/10.1590/S0036-4665200500050000365. Fleming, A. (2007). Zebrafish as an alternative model organism for disease modelling and drug discovery : implications for the 3Rs. NC3Rs, 10(Figure 1), 1–7. http://doi.org/www.nc3rs.org.uk

 

Universiteit of Hogeschool
Farmaceutische wetenschappen
Publicatiejaar
2015
Kernwoorden
Deel deze scriptie