Expressie van recombinante antigenen in Leishmania tarentolae en Escherichia coli

Robin Schelfhout
Om een diagnostische test te ontwikkelen voor een recent ontdekte schimmel wordt een merker (eiwit) recombinant tot expressie gebracht met verschillende expressiesystemen. Anderzijds wordt ook het RoTat1.2-eiwit recombinant tot expressie gebracht, zodanig dat dit in de bestaande diagnostische test het 'natief' verkregen (gebruik proefdieren) RoTat1.2 kan vervangen.

Nood aan specifieke diagnostische testen voor pathogenen in tropische gebieden

Als gevolg van de klimaatsveranderingen, toenemende handel (landbouw), migratie en toerisme worden tropische gebieden jaarlijks geconfronteerd met steeds nieuwe pathogenen (ziekteverwekkers van biologische oorsprong). Deze kunnen afhankelijk van de algemene gezondheid/immuniteit van de lokale bevolking zorgen voor grote gezondheidsproblemen. Een voorbeeld hiervan is de recente uitbraak van het Zika-virus in Zuid-Amerika. Ook kunnen zij een impact op de economie gaan veroorzaken, indien ze infectieus zijn voor het vee van de lokale bevolking. Om deze redenen is er nood aan specifieke diagnostische testen, waarmee de ziekteverwekker snel kan worden herkend en een behandeling kan gestart worden.

Om een specifieke diagnostische test (Bijlage: afbeelding 1) te bekomen die eenvoudig te gebruiken is en betaalbaar, is er nood aan onderzoek naar de bio-moleculaire aspecten van het organisme. Hierdoor kan een merker (eiwit) worden geselecteerd dat kan dienen als basis voor de diagnostische test. Deze merker zal in grote hoeveelheden aanwezig zijn in de test en zal een reactie kunnen veroorzaken indien antilichamen (aanwezig in bloed van geïnfecteerde patiënt) gericht tegen deze merker erop zullen binden.

Recent is in Zuid-Afrika een nieuw pathogeen ontdekt, een schimmel die infecties veroorzaakt bij aidspatiënten. Deze nieuwe schimmel werd oorspronkelijk geklasseerd onder de genus Emmonsia als Emmonsia sp. Na verder onderzoek naar de morfologie en genetica van deze schimmel werd besloten een de nieuwe genus te benoemen: Emergomyces, waaronder Emmonsia sp. nu geklasseerd staat als Emergomyces africanus. Door het stijgende aantal aidspatiënten waarbij een mycose wordt vastgesteld veroorzaakt door Emergomyces africanus (Bijlage: afbeelding 2) is er nood aan een diagnostische test. Op heden gebeurt de identificatie ervan met behulp van PCR (polymerasekettingreactie; breed-bereik fungale PCR in dit geval), maar dit proces kan tot 3 weken tijd in beslag nemen waardoor een sneller en goedkoper alternatief nodig is.

Voor de ontwikkeling van een diagnostische test moet er – zoals eerder vermeld – gezocht worden naar een specifieke merker (eiwit) van deze schimmel, dat kan dienen als basis voor de test. Dit werd reeds eerder onderzocht door Tom Kalathil Raju onder begeleiding van Prof. Chris Kenyon en Prof. Philippe Büscher. Hierbij werd een eiwit gevonden dat specifiek is en potentieel gebruikt kan worden als merker voor een diagnostische test: Eiwit A.

Een volgende stap in het maken van een diagnostische test is het Eiwit A in grote hoeveelheden gaan produceren. Dit is mogelijk door het eiwit recombinant tot expressie te brengen (doel van deze scriptie), d.w.z. het eiwit tot expressie brengen in een gastheercel die van nature dit eiwit niet aanmaakt. In deze scriptie werd er gebruik gemaakt van twee verschillende gastheercellen (expressiesystemen): Leishmania tarentolae (pLEXSY-expressiesysteem van Jena Bioscience) en Escherichia coli (PET-expressiesysteem). Om het eiwit tot expressie te kunnen brengen in beide gastheercellen, werd het gen van Eiwit A (afkomstig van Emergomyces Africanus) geïntegreerd in een plasmide (cirkelvormig stukje DNA). Deze plasmiden zijn specifiek bedoeld voor de gastheercel: voor Leishmania tarentolae = pLEXSY_I-blecherry3 en voor Escherichia coli = pET22b-(+). Om de integratie van het gen in de plasmiden te controleren werden de bekomen plasmiden opgestuurd naar een extern bedrijf om de exacte sequentie ervan te laten bepalen. Op deze manier is het mogelijk na te gaan indien het doelwitgen succesvol is geïntegreerd in de plasmiden. De resultaten toonden aan dat de bekomen plasmiden effectief het gen bevatten en de klonering dus geslaagd is. Deze cirkelvormige stukjes DNA hebben als doel het gen (Eiwit A) te integreren in het DNA van de gastheercel, zodanig dat deze in staat is het eiwit tot expressie te brengen. In een volgende stap zullen de plasmiden dan ook in de gastheercellen worden gebracht.

Naast het ontwikkelen van diagnostische testen is het anderzijds belangrijk bestaande testen te optimaliseren. Dit is het geval bij een bestaande diagnostische test voor de parasiet Trypanosoma evansi (Bijlage: afbeelding 3) op te sporen. Deze infectieuze parasiet veroorzaakt de ziekte surra bij paarden, kamelen, runderen, buffels, honden, katten etc. Verspreiding van deze parasiet gebeurt door bijtende insecten (Tabanidae en Stomoxys) of vampiervleermuizen. Hierdoor komt deze ziekte wijdverspreid voor in tropische gebieden en veroorzaakt deze grote economische en financiële verliezen voor plaatselijke boeren. Diagnose gebeurt op heden met behulp van serodiagnostische testen (opsporen antilichamen) waarbij antistoffen gericht tegen het eiwit RoTat1.2 (merker) worden opgespoord. Dit eiwit komt wijdverspreid voor op de oppervlakte van de parasiet.

Voor het verkrijgen van het eiwit RoTat1.2 wordt er tot op heden gebruikt gemaakt van proefdieren, waardoor dit minder ethisch verantwoord is. Om deze reden wordt er getracht dit eiwit te bekomen door het recombinante expressie (zelfde principe als uitgevoerd bij Emergomyces africanus). Op deze manier zijn er geen proefdieren nodig. De kloneringsstappen werden eerder uitgevoerd. In deze scriptie werd nagegaan of de cellen (waarin het gen succesvol werd geïntegreerd in het DNA) effectief het RoTat1.2-eiwit tot expressie brengt.

Om de eiwitexpressie te analyseren werd aan de gekloneerde cellen een inducer (induceert de expressie) toegevoegd. Hierna werden de cellen gelyseerd (kapotgemaakt) en de eiwitten er vervolgens uit geëxtraheerd. Dit mengsel van eiwitten (doeleiwit + eiwitten van het organisme zelf) werd vervolgens opgezuiverd zodanig dat in theorie enkel het doeleiwit (RoTat1.2) overblijft. Waarna m.b.v. verschillende analysetechnieken werd nagegaan indien het dit effectief het RoTat1.2-eiwit is. Uiteindelijk kon er hier worden besloten dat enkele cellen effectief het eiwit tot expressie hebben gebracht. In een volgende stap kan er nu worden nagegaan of dit ‘recombinante’ RoTat1.2 dezelfde eigenschappen vertoond als het ‘natief’ (verkregen via proefdieren) RoTat1.2.

Jaarlijks worden er steeds nieuwe pathogenen ontdekt, die al dan niet gevaarlijk kunnen zijn voor mens en dier. Daarom is het van cruciaal belang om onderzoek te verrichtten naar deze pathogenen. Om zo diagnose bij andere patiënten te kunnen versnellen en eventuele behandelingen te kunnen ontwikkelen. 

Bibliografie

Abera, Z., Usmane, A., & Ayana, Z. (2015). Review on Camel Trypanosomosis: its Epidemiology and Economic Importance. Acta Parasitologica, 6(2): 117-128. doi:10.5829/idosi.apg.2015.6.2.94253

Baral, T. N. (2010). Immunobiology of African Trypanosomes: Need of Alternative Interventions. Journal of Biomedicine and Biotechnology. doi:10.1155/2010/389153

Basile, G., & Peticca, M. (2009). Recombinant Protein Expression in Leishmania tarentolae. Hamilton Robotics, 43: 273-278. doi:10.1007/s12033-009-9213-5

Birhanu, H., Stijn, R., Simon, T., Baelmans, R., Gebrehiwot, T., Goddeeris, B. M., & Büscher, P. (2015). Surra Sero K-SeT, a new immunochromatographic test for serodiagnosis of Trypanosoma evansi infection in domestic animals. Veterinary Parasitology, 211: 153-157. doi:10.1016/j.vetpar.2015.05.008

Büscher , P., Mertens, P., Leclipteux, T., Gilleman, Q., Jacquet, D., Mumba-Ngoyi, D., . . . Lejon, V. (2014). Sensitivity and specifi city of HAT Sero-K-SeT, a rapid diagnostic test for serodiagnosis of sleeping sickness caused by Trypanosoma brucei gambiense: a case-control study. The Lancet Global Health. doi:10.1016/S2214-109X(14)70203-7

Committee, W. E. (2013). Control and surveillance of human African trypanosomiasis. Geneva: World Health Organization.

Desquesnes, M., Holzmuller, P., Lai, D.-H., Dargantes, A., Lun, Z.-R., & Jittaplapong, S. (2013). Trypanosoma evansi and Surra: A Review and Perspectives on Origin, History, Distribution, Taxonomy, Morphology, Hosts, and Pathogenic Effects. BioMed Research Iternational, 2013: 22. doi:10.1155/2013/194176

Kenyon, C., Bonorchis, K., Corcoran, C., Meintjes, G., & Colebunders, R. (2013). A Dimorphic Fungus Causing Disseminated Infection in South Africa. The New England Journal of Nedicine, 369: 1416-1424. doi:10.1056/NEJMoa1215460

Maudlin, I., Holmes, P. H., & Miles, M. A. (2004). The Trypanosomiases. Oxfordshire: CABI Publishing.

Njiru, Z. K., Constantine, C. C., Ndung'u, J. M., Robertson, I., Okaye, S., Thompson, R. C., & Reid, S. A. (2004). Detection of Trypanosoma evansi in camels using PCR and CATT/T. evansi tests in Kenya. Veterinary Parasitology, 124: 187-199. doi:10.1016/j.vetpar.2004.06.029

Pays, E., Vanhamme, L., & Pérez-Morga, D. (2004). Antigenic variation in Trypanosoma brucei: facts, challenges ans mysteries. Microbiology, 7: 369-374. doi:10.1016/j.mib.2004.05.001

Raju, T. K. (2015-2016). Investigation of a Species Specific Antigen for Diagnosis of Infection with a New Emmonsia Species. Institute of Tropical Medicine, Antwerp: Universiteit Antwerpen.

Rogé, S., Van Reet, N., Odiwuor, S., Tran, T., Schildermans, K., Vandamme, S., . . . Büscher, P. (2013). Recombinant expression of trypanosome surface glycoproteins in Pichia pastoris for the diagnosis of Trypanosoma evansi infection. Veterinary Parasitology. doi:10.1016/j.vetpar.2013.05.009

Rosano, G. L., & Ceccarelli, E. A. (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Microbiology, 5: 172. doi:10.3389/fmicb.2014.00172

Sarosi, G. A., & Davies, S. F. (1996). Endemic Mycosis Complicating Human Immunodeficiency Virus Infection. WJM, 164(4).

Schwartz, I. S., Govender, N. P., Corcoran, C., Dlamini, S., Prozesky, H., Burton, R., . . . Kenyon, C. (2015). Clinical Characteristics, Diagnosis, Management, and Outcomes of Disseminated Emmonsiosis: A Retrospective Case Series. OXFORD ACADEMIC, 61(6): 1004-1012. doi:10.1093/cid/civ439

Schwartz, I. S., Kenyon, C., Feng, P., Govender, N. P., Dukik, K., Sigler, L., . . . de Hoog, G. (2015). 50 Years of Emmonsia Disease in Humans: The Dramatic Emergence of a Cluster of Novel Fungal Pathogens. PLoS Pathogen, 11(11): e1005198. doi:10.1371/journal.ppat.1005198

Schwede, A., Macleod, O. J., MacGregor, P., & Carrington, M. (2015). How Does the VSG Coat of Bloodstream Form African Trypanosomes Interact with External Proteins? PLoS Pathog, 11(12). doi:10.1371/journal.ppat.1005259

Verloo, D., Magnus, E., & Büscher, P. (2001). General expression of RoTat 1.2 variable antigen type in Trypanosoma evansi isolates from different origin. Veterinary Parasitology, 97: 183-189.

 

Universiteit of Hogeschool
Biomedische laboratoriumtechnologie
Publicatiejaar
2017
Promotor(en)
Prof. Dr. Philippe Büscher
Kernwoorden
Share this on: