Hoe een kleine mutatie in een kattenvirus levens kan redden: Op zoek naar een betere test voor FIP
Anke
Deconinck
Inleiding
Stel je voor: je hebt een kat die plots lusteloos wordt, niet meer eet en een opgezwollen buik krijgt. De diagnose? Feline Infectieuze Peritonitis (FIP), een dodelijke virale ziekte die vooral jonge katten treft. Tot voor kort was FIP een doodvonnis, maar dankzij nieuwe medicijnen is behandeling mogelijk, als de ziekte op tijd ontdekt wordt. En daar knelt het schoentje.
In mijn bachelorproef zocht ik naar een manier om FIP sneller en betrouwbaarder op te sporen. Niet met bloedtesten of scans, maar via een moleculaire zoektocht in het virus-DNA. Want net zoals een enkele verkeerde letter in een boek de hele plot kan veranderen, zorgt een kleine mutatie in het FCoV-virus ervoor dat het onschuldige darmsnottertje verandert in een levensgevaarlijke killer. Mijn missie? Die mutatie vangen met een precisietest en zo duizenden kattenlevens redden.
Het virus dat twee gezichten heeft
FCoV (het kattencoronavirus) is een sluipmoordenaar met een split personality. Bij de meeste katten veroorzaakt het hooguit milde diarree. Maar bij sommigen muteert het virus tot FIPV, een agressieve variant die organen aanvalt. Het probleem? De bestaande tests kunnen de gevaarlijke mutatie vaak niet betrouwbaar onderscheiden van het onschuldig virus.
PCR: een moleculair vergrootglas
PCR-testen werken als een kopieermachine voor DNA. Maar bij FIPV is het alsof je een speld in een hooiberg zoekt: het virus verschuilt zich in bloed, weefsels én ontlasting. Ik optimaliseerde daarom de test met twee slimme trucs:
- Nieuwe ‘zoekhonden’ voor de mutatie: Ik ontwierp speciale primers en probes die specifiek de M1058L-mutatie in het spike-eiwit opsporen – de genetische vingerafdruk van FIPV.
- Een digitale upgrade: Digitale PCR, een hypergevoelige techniek, bleek tot 94% nauwkeurig in het detecteren van FIPV in buikvocht, zelfs bij minimale virussporen.
Vergelijking met een securitycamera:
- Traditionele PCR: Een bewakingscamera met wazig beeld.
- Mijn geoptimaliseerde test: Een 4K-camera die precies de mutatie spot tussen duizenden virusdeeltjes.
Waarom dit belangrijk is voor jouw kat
- Vroegtijdige diagnose: FIP is nu te behandelen, maar enkel als je er vroeg bij bent. Mijn test reduceert vals-negatieven.
- Kostenefficiëntie: Geen dure biopten meer nodig – eenvoudig ontlastingsonderzoek volstaat.
- Preventie: Cattery’s kunnen besmette katten sneller isoleren, waardoor uitbraken beperkt blijven.
Slot
FIP is geen doodvonnis meer, maar dan moet de test wél de juiste vijand vinden. Met deze doorbraak komen we een stap dichter bij een wereld waar elke kat de juiste behandeling krijgt, nog vóór het virus toeslaat. Want zoals elke kattenliefhebber weet: achter die pluizige kop schuilt een vechter die het verdient om elke kans te krijgen.
Bibliografie
- AAT Bioquest. (2023, april 27). In PCR, what are the functions of DMSO? AAT Bioquest. https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/in-pcr-what-are-the- functions-of-dmso
- Beck, I. (2023). Biotechnologie I: DNA en RNA. Odisee.
- Benchling. (z.d.). Primer Design. Geraadpleegd 25 maart 2025, van https://www.benchling.com/primer-design-for-pcr
- Bio-Rad. (z.d.-a). cDNA Synthesis. Geraadpleegd 21 februari 2025, van https://www.bio-rad.com/en-be/feature/cdna-synthesis.html
- Bio-Rad. (z.d.-b). iTaq Universal Probes One-Step Kit, 100 x 20 μl rxns, 1 ml #1725140. Geraadpleegd 21 februari 2025, van https://www.bio-rad.com/en-be/sku/1725140-itaq-universal-probes-one-step-kit-100-x-20-ul-rxns-1-ml?ID=1725140
- Bio-Rad. (z.d.-c). iTaqTM Universal Probes Supermix, 200 x 20 μl rxns, 2 ml (2 x 1 ml) #1725130. Geraadpleegd 21 februari 2025, van https://www.bio-rad.com/en-be/sku/1725130-itaq-universal-probes-supermix-200-x-20-ul-rxns-2-ml-2-x-1-ml?ID=1725130
- Bio-Rad. (z.d.-d). Reliance One-Step Multiplex RT-qPCR Supermix. Geraadpleegd 27 februari 2025, van https://www.bio-rad.com/en-be/product/reliance-one-step-multiplex-rt-qpcr-supermix?ID=PPO4M7TU86LJ
- Bio-Rad. (z.d.-e). Reliance Select cDNA Synthesis Kit. Geraadpleegd 21 februari 2025, van https://www.bio-rad.com/en-be/product/reliance-select-cdna-synthesis-kit?ID=Q6OMF3E08O1Y
- Bio-Rad Laboratories Inc. (z.d.). Reliance Select cDNA Synthesis Kit. Geraadpleegd 21 februari 2025, van https://www.bio-rad.com/sites/default/files/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000124806.pdf
- Bio-Synthesis Inc. (2008, september 2). LNA Oligonucleotide Lock Nucleic Acid (LNA) LNA Hybridizes. FAQ. https://www.biosyn.com/faq/lna-design-guidelines.aspx
- Biotium. (z.d.-a). EVAGREEN® DYE For qPCR & Other Applications. Geraadpleegd 24 maart 2025, van https://biotium.com/technology/pcr-dna-amplification/evagreen-dye-for-qpcr/ Biotium. (z.d.-b). EvaGreen® Plus Dye, 20X in Water.
- Bustin, S., & Huggett, J. (2017). qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification, 14, 19–28. https://doi.org/10.1016/j.bdq.2017.11.001
- C. Condon, J. (2024). IDT Primer and gBlock Hydration and Aliquots SOP v1. https://doi.org/10.17504/protocols.io.e6nvw1r77lmk/v1
- CBD. (2017, februari 17). Manual Primer Design for a gene on the reverse strand. Biology. https://biology.stackexchange.com/questions/56304/manual-primer-design-for-a-gene-on-the-reverse-strand
- Deharvengt, S. J., Petersen, L. M., Jung, H.-S., & Tsongalis, G. J. (2020). Nucleic acid analysis in the clinical laboratory. In Contemporary Practice in Clinical Chemistry (pp. 215–234). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-815499-1.00013-2
- Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. Journal of Visualized Experiments, 1. https://doi.org/10.3791/2565
- Gao, Y., Liang, X., Wang, Q., Zhang, S., Zhao, H., Wang, K., Hu, G., Liu, W. J., & Gao, F. (2022). Mind the feline coronavirus: Comparison with SARS-CoV-2. Gene, 825, 146443. https://doi.org/10.1016/j.gene.2022.146443
- Gao, Y.-Y., Wang, Q., Liang, X.-Y., Zhang, S., Bao, D., Zhao, H., Li, S.-B., Wang, K., Hu, G.-X., & Gao, F.-S. (2023). An updated review of feline coronavirus: mind the two biotypes.Virus Research, 326, 199059. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2023.199059 García-Alegría, A. M., Anduro-Corona, I., Pérez-Martínez, C. J., Guadalupe Corella-Madueño, M. A., Rascón-Durán, M. L., & Astiazaran-Garcia, H. (2020). Quantification of DNA through the NanoDrop Spectrophotometer: Methodological Validation Using Standard Reference Material and Sprague Dawley Rat and Human DNA. International Journal of Analytical Chemistry, 2020, 1–9. https://doi.org/10.1155/2020/8896738
- Indical Bioscience. (z.d.). IndiMag 48s. Geraadpleegd 21 februari 2025, van https://shop.indical.com/en/instruments-and-plastics/indimag-48s.html
- Indical Bioscience. (2021, maart). IndiMag 48s User Manual. https://shop.indical.com/out/media/HB-2556-EN-002-IndiMag48s-UserManual-Mar- 2021.pdf
- invitrogen (ThermoFisher). (z.d.). DNA-freeTM Kit User Guide. Geraadpleegd 21 februari 2025, van https://assets.fishersci.com/TFS-Assets/LSG/manuals/cms_055739.pdf
- Khehra, N., Padda, I. S., & Swift, C. J. (2023). Polymerase Chain Reaction (PCR). In StatPearls [Internet]. StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK589663/
- Kuznetsova, A. A., Fedorova, O. S., & Kuznetsov, N. A. (2022). Structural and Molecular Kinetic Features of Activities of DNA Polymerases. International Journal of Molecular Sciences, 23(12), 6373. https://doi.org/10.3390/ijms23126373
- Levin, J. D., Fiala, D., Samala, M. F., Kahn, J. D., & Peterson, R. J. (2006). Position-dependent effects of locked nucleic acid (LNA) on DNA sequencing and PCR primers. Nucleic Acids Research, 34(20), e142–e142. https://doi.org/10.1093/nar/gkl756
- MagBio Genomics Inc. (2022, februari 22). What are Magnetic Beads and How Do They Work for Isolation of Biomolecules? https://www.magbiogenomics.com/latest/post/what-are- magnetic-beads-and-how-do-they-work-for-isolation-of- biomolecules#:~:text=How%20does%20magnetic%20bead%20DNA,the%20magnetic% 20field%20is%20removed.
- Markham, N. R., Zuker, L. S., & Suker, M. (z.d.). UNAFold. Geraadpleegd 24 februari 2025, van https://www.unafold.org
- metabion. (z.d.). LNA primers and probes. Geraadpleegd 6 maart 2025, van https://www.metabion.com/knowledge-hub/products/lna-primers-and-probes
- National Institute of Health (NIH). (z.d.). single nucleotide variant. Geraadpleegd 24 februari 2025, van https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/genetics- dictionary/def/single-nucleotide-variant#
- Pratelli, A. (2008). Comparison of Serologic Techniques for the Detection of Antibodies against Feline Coronaviruses. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 20(1), 45–50. https://doi.org/10.1177/104063870802000108
- PREMIER Biosoft. (z.d.). PCR Primer Design Guidelines. Geraadpleegd 25 maart 2025, van http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html
- QIAGEN. (z.d.). What is LNA and Why is it Such a Powerful Research Tool. Geraadpleegd 20 februari 2025, van https://www.qiagen.com/be/knowledge-and-support/knowledge- hub/technology-and-research/lna-technology/power-of-lna/what-is-lna/lna-powerful- research-tool#References
- Quan, P.-L., Sauzade, M., & Brouzes, E. (2018). dPCR: A Technology Review. Sensors, 18(4), 1271. https://doi.org/10.3390/s18041271
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., & Andrade, M. J. (2015). Design of Primers and Probes for Quantitative Real-Time PCR Methods. In Methods in Molecular Biology (Vol. 1275, pp. 31–56). Springer. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2365-6_3
- Rychlik, W., Spencer, W. J., & Rhoads, R. E. (1990). Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro ; Nucleic Acids Research, 18(21), 6409–6412. https://doi.org/10.1093/nar/18.21.6409
- Shen, C.-H. (2019). Amplification of Nucleic Acids. In Diagnostic Molecular Biology (pp. 215– 247). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802823-0.00009-2
- Sigma-Aldrich. (z.d.). Dimethyl sulfoxide Product Information. Sigma-Aldrich. Geraadpleegd 10 april 2025, van https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/712/92 1/d8418pis.pdf?srsltid=AfmBOoq8uuww6Yt13jDF8m4uYNni2_3JBmUYNo4KyUng9bEn IfXHwx51
- Tavares, L., Alves, P. M., Ferreira, R. B., & Santos, C. N. (2011). Comparison of different methods for DNA-free RNA isolation from SK-N-MC neuroblastoma. BMC Research Notes, 4(1), 3. https://doi.org/10.1186/1756-0500-4-3
- Thermo Fisher Scientific. (z.d.). Properties of Reverse Transcriptase. Geraadpleegd 20 februari 2025, van https://www.thermofisher.com/be/en/home/life- science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/rt- education/reverse-transcriptase-attributes.html
- ThermoFisher. (z.d.). Multiple Primer Analyzer. Geraadpleegd 5 maart 2025, van https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular- biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo- scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html
- ThermoFisher Scientific. (z.d.-a). Basic Principles of RT-qPCR. Geraadpleegd 20 februari 2025, van https://www.thermofisher.com/be/en/home/brands/thermo- scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology- resource-library/spotlight-articles/basic-principles-rt-qpcr.html
- ThermoFisher Scientific. (z.d.-b). DNA-freeTM DNA Removal Kit. Geraadpleegd 21 februari 2025, van https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906
- Thornton, B., & Basu, C. (2015). Rapid and Simple Method of qPCR Primer Design. In C. Basu (Red.), Methods in Molecular Biology (Vol. 1275, pp. 173–179). Springer. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2365-6_13
- Torsvik, V., Daae, F. L., Sandaa, R.-A., & Øvreås, L. (1998). Novel techniques for analysing microbial diversity in natural and perturbed environments. Journal of Biotechnology, 64(1), 53–62. https://doi.org/10.1016/S0168-1656(98)00103-5
- Yadav, G. (2015). So, How Can the Sso7d Fusion Polymerase Technology Help Your PCR? Bioradiations. https://www.bioradiations.com/so-how-can-the-sso7d-fusion-polymerase- technology-help-your-pcr/
- You, Y. (2006). Design of LNA probes that improve mismatch discrimination. Nucleic Acids Research, 34(8), e60–e60. https://doi.org/10.1093/nar/gkl175
- Zoolyx. (z.d.). Handleiding IM-48.
